分子细胞科学卓越创新中心“青年学者”论坛第十一期—Artificial sperm mediated genetic screening in primordial germ cell development
日期: 2018-12-04
2018年11月30日分子细胞科学卓越创新中心“青年学者”论坛第十一期在新生化大楼312报告厅举行。“青年学者”论坛由生化与细胞所细胞生物学重点实验室、分子生物学重点实验室及研究生会共同主办。本期活动邀请报告人的是来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所李庆博士。
报告中,李庆博士向大家介绍了他们于2018年10月1日发表在Nature Cell Biology的研究成果“CRISPR–Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development”, 利用最新的CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑系统 结合单倍体胚胎干细胞(“人造精子”)介导的半克隆技术,对影响小鼠原始生殖细胞发育的重要基因Dnd1实现个体水平氨基酸功能位点的遗传筛选。
首先,李庆博士向大家介绍了“人造精子”的概念,人造精子,也称为孤雄单倍体胚胎干细胞,有两种方式获得,第一种是通过核移植的方式去除成熟卵母细胞的核,然后注入一个精子形成携带来自父本基因组的单倍体重构胚胎,这些胚胎在体外能够发育到囊胚,从这些囊胚中分离建立单倍体胚胎干细胞系;另一种方法是将受精卵中的雌原核去除,由雄原核发育而来的干细胞系也称为单倍体胚胎干细胞,孤雄单倍体胚胎干细胞之所以称为“人造精子”,是因为在一定程度上,其可以代替精子,注入卵母细胞获得健康小鼠。
接着,李庆博士介绍了他们实验室2015年的研究成果,通过删除两个印记调控区域(Differentially Methylated Region, DMR)H19-DMR和IG-DMR,获得了能够高效产生半克隆小鼠的孤雄单倍体胚胎干细胞。此外,李庆博士介绍了2016年David R. Liu课题组建立了基于CRISPR/Cas9技术的高效诱导单一核苷酸突变的胞嘧啶单碱基编辑器,通过nickase Cas9蛋白(nCas9)上偶联大鼠胞嘧啶脱氨酶(rAPOBEC1),可以将靶位点C•G转变为T•A。基于上述前期研究成果,李庆博士所在课题组推测,“人造精子”介导的半克隆技术与BE3技术结合,有可能实现特定蛋白质关键氨基酸的在体遗传筛选。
他们首先在小鼠胚胎干细胞系中,通过胞嘧啶单碱基编辑器的N端和C端同时加上一个核定位序列,建立了高效的单碱基编辑系统。之后,他们将该系统应用于小鼠“人造精子”上,发现优化的BE3不仅可以在“人造精子”上实现高效的单碱基编辑,将携带BE3的“人造精子”注入卵子还可以高效地产生纯合点突变的半克隆小鼠。紧接着,他们向“人造精子”中导入了一个靶向Dnd1基因的一个sgRNA慢病毒文库(含77个sgRNA),发现能在半克隆小鼠中高效地诱导不同位点的单碱基突变。通过两轮的遗传筛选,他们发现并验证DND1的E59K、V60M、P76L和G82R对PGCs的发育具有重要作用。
之后,李庆博士课题组通过与陈勇课题组合作,他们通过蛋白结构的预测、突变后蛋白的稳定性、蛋白与蛋白相互作用等多个层次分析发现这些位点对于DND1蛋白质稳定性和其与其它蛋白质相互作用起着关键的作用。
在讨论环节,观众提出了一系列问题,李庆博士一一进行了解答。讲座之后,李庆博士向生化所的师生,表达了自己的谢意,同时盛情欢迎大家与他进行交流科研,也祝福大家能顺利完成学业。分子细胞科学卓越创新中心 “青年学者”论坛第十一期活动圆满结束!