技术分享：tTARGIT AAVs系统助力特定神经元研究

Tips：关于位点特异性重组酶（SSR），我们在“一个集合Vika、Flp、Dre和Cre重组系统的报告基因小鼠模型”技术分享中已经介绍了四种SSR系统的联用。关于AAV，我们在“心房特异性的AAV9递送系统”技术分享中介绍了通过设计特定载体，实现AAV9的心房特异性基因递送。本期我们将详细介绍设计联用两种SSR系统与Tet-off系统，并借助AAV原位注射系统进行基因递送，以实现特定神经元的特异性标记与功能研究。

位点特异性重组酶（SSR）是一类具有催化活性，能够特异性识别DNA序列，实现位点特异性重组的基因操作工具。其中Cre、Flp和Dre系统最为常用，在基因工程中发挥着关键作用。Tet-off系统中当四环素不存在时，tTA可结合到TRE启动子上，驱动下游目的基因表达；而当四环素存在时，tTA构象发生改变并从TRE启动子上脱落，从而关闭下游目的基因表达。组合联用SSR系统与Tet-off系统，可实现更为精准的基因操作，用于各种生命科学研究。

2021年3月，eLife上发表了一种双重重组酶依赖激活基因表达的系统——tTARGIT AAVs系统，以实现更加精确地遗传靶向特定神经元细胞亚群，及其功能研究[1]。该系统利用腺相关病毒（AAV）来进行基因递送，包含Driver AAV和Payload AAV两种AAV载体。其中Driver AAV为组织特异性启动子驱动表达的Flp依赖双floxed倒置tTA，而Payload AAV为TRE启动子驱动表达的Cre依赖双floxed倒置目的基因（图一a）。当不存在四环素时，Flp可识别重组Driver AAV的双floxed序列使得tTA翻转回正向，从而在组织特异性启动子的驱动下表达tTA；同时，Cre可识别重组Payload AAV的双floxed序列使得目的基因翻转回正向，在表达tTA的特定组织细胞中tTA结合TRE启动子，驱动下游目的基因的表达（图一a）。因此，这套tTARGIT AAVs系统需要Driver AAV、Payload AAV、Flp和Cre这四要素的同时存在，目的基因才能稳定表达。并且加入四环素，可关闭目的基因表达。

图一 tTARGIT AAVs系统的工作原理与LepRb^VMH神经元标记测试[1]

研究者利用tTARGIT AAVs系统来测试标记特定神经元细胞亚群。瘦素（Leptin）是一种由脂肪组织分泌的肽类激素，作用于瘦素受体（LepR）。LepR在下丘脑中表达，其中表达瘦素受体b（LepRb）的神经元介导瘦素调控的大部分功能。表达LepRb的神经元多位于下丘脑的核团中，包括弓状核（ARC）、背内侧核（DMH）、腹内侧核（VMH）、下丘脑外侧区（LHA）和腹侧前乳头核（PMv）。下丘脑腹内侧核LepRb (LepRb^VMH)神经元可通过调控摄食量来控制能量平衡[2, 3]。由于其密度高且临近弓状核、背内侧和外侧区域，LepRb^VMH神经元不能简单用Lepr^Cre小鼠进行标记研究。另外，Slc17a6主要表达在LepRb^VMH神经元中，且在周围的LepRb神经元中大多不表达[4]。之前有报道利用Slc17a6^FlpO、Lepr^Cre、Flp和Cre依赖的Rosa26^{RCFL-eGFP-L10a}报告小鼠、或者INTRSECT AAV系统[5]来标记LepRb^VMH神经元，但是这些系统仍然缺乏特异性和敏感性。因此，研究者选择LepRb^VMH神经元来进行tTARGIT AAVs系统的标记测试。

首先，研究者构建了人源synapsin I (hSYN1)启动子驱动的Driver AAV-hSYN1-fDIO-tTA，和表达ChR2-TdTomato的Payload AAV-TRE-DIO-ChR2-TdT。并将这两种AAVs分别原位注射到野生型、Slc17a6^FlpO、Lepr^Cre以及Slc17a6^FlpO;Lepr^Cre小鼠的VMH区，免疫荧光结果显示只有Slc17a6^FlpO;Lepr^Cre小鼠的VMH区有很强的红色荧光信号（图一b和c）；且只有共同注射两种AAVs才有强信号（图一d和e）。

接下来，研究者利用tTARGIT AAVs系统来定位LepRb^VMH神经元的神经投射。构建了Payload AAV-TRE-DIO-GFP-2A-SynmRuby，用于表达GFP以及Synaptophysin-mRuby融合蛋白（图二a）。Synaptophysin蛋白是突触标志物，定位于突触囊泡上，与mRuby融合后可用红光进行检测。但由于红光信号不强，研究者直接观察GFP绿色荧光标记的LepRb^VMH神经元的神经投射。将Payload AAV和Driver AAV共同原位注射到Slc17a6^FlpO;Lepr^Cre小鼠的VMH区（图二a），可观察到VMH区的强GFP绿色荧光信号（图二b），并且GFP标记的LepRb^VMH神经元可以投射至中枢神经中的导水管周围灰质（PAG）、弓状核（ARC）、丘脑室旁核(PVT)、下丘脑室旁核（PVN）、终纹床核（BNST）和视前区（POA）（图二c和d）。这与已知的VMH神经投射结果一致[6-8]。

图二 利用tTARGIT AAVs系统定位LepRb^VMH神经元的神经投射[1]

最后，研究者进一步研究LepRb^VMH神经元对饮食代谢的功能影响，构建了表达hM3Dq-mCherry的Payload AAV-TRE-DIO-hM3Dq-mCherry。其中hM3Dq是DREADD系统的人工设计蛋白受体，可特异性被人工设计药物CNO激活，进而激活神经元。将Payload AAV与Driver AAV共同原位注射到Slc17a6^FlpO;Lepr^Cre小鼠的VMH区（图三a），可检测到VMH区的hM3Dq-mCherry红光荧光强信号（图三b）。当用CNO激活后，可特异性在VMH区中检测到mCherry和神经元激活标志物FOS的表达共定位，表明LepRb^VMH神经元被特异性激活（图三c和d）。研究者将小鼠饲养于代谢笼中，每天喂食两次CNO，观测LepRb^VMH神经元的激活对小鼠的能量消耗、活动与摄食的影响（图三e-j）。结果显示，当CNO激活LepRb^VMH神经元后，小鼠的24小时耗氧量 (VO₂) 和能量消耗均显著增加（图三e和h），而夜间活动、食物摄取量和日间呼吸交换率均显著减少（图三g，i和j）。为了解棕色脂肪组织 (BAT)在此过程中是否起作用，研究者在小鼠肩胛上放置了温度探头以监测BAT的产热情况。发现当CNO激活LepRb^VMH神经元后，小鼠的肩胛温度显著增加（图三k和l）。表明LepRb^VMH神经元激活后，可部分通过增加BAT产热来促进能量消耗，进一步证明了LepRb^VMH神经元对机体能量平衡的重要调节作用。

图三 LpRb^VMH神经元的激活对小鼠饮食与能量代谢的影响[1]

综上所述，利用双重重组酶依赖激活基因表达的tTARGIT AAVs系统可精准操纵LepRb^VMH神经元，并用于中枢神经系统中特定细胞亚群的功能研究。此外，研究者还扩展了一系列用于条件性开启或关闭基因表达的tTARGIT AAVs工具包（表一）。其中Driver AVV分为表达tTA和rtTA两种，前者为Tet-off系统，表达无需加药；后者为Tet-on系统，需要在加药情况下才能激活表达。而Payload AAV根据目标基因序列的方向可分为Flp-ON/Cre-ON和Flp-ON/Cre-OFF两类。这些工具包的灵活使用极大丰富了生物医学研究技术，科学家可根据目标研究基因和具体研究对象选择不同组合的tTARGIT AAVs系统。

表一 可用的tTARGIT AAVs系统工具包[1]

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参考文献

1. Sabatini PV, Wang J, Rupp AC, Affinati AH, Myers MG: tTARGIT AAVs mediate the sensitive and flexible manipulation of intersectional neuronal populations in mice. eLife Sciences 2021, 10:e66835.

2. Bingham NC, Anderson KK, Reuter AL, Stallings NR, Parker KL: Selective loss of leptin receptors in the ventromedial hypothalamic nucleus results in increased adiposity and a metabolic syndrome. Endocrinology 2008, 149(5):2138-2148.

3. Dhillon H, Zigman JM, Ye C, Lee CE, McGovern RA, Tang V, Kenny CD, Christiansen LM, White RD, Edelstein EA et al: Leptin directly activates SF1 neurons in the VMH, and this action by leptin is required for normal body-weight homeostasis. Neuron 2006, 49(2):191-203.

4. Vong L, Ye C, Yang Z, Choi B, Chua S, Jr., Lowell BB: Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron 2011, 71(1):142-154.

5. Fenno LE, Mattis J, Ramakrishnan C, Hyun M, Lee SY, He M, Tucciarone J, Selimbeyoglu A, Berndt A, Grosenick L et al: Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic. Nature methods 2014, 11(7):763-772.

6. Canteras NS, Simerly RB, Swanson LW: Organization of projections from the ventromedial nucleus of the hypothalamus: a Phaseolus vulgaris-leucoagglutinin study in the rat. The Journal of comparative neurology 1994, 348(1):41-79.

7. Zhang J, Chen D, Sweeney P, Yang Y: An excitatory ventromedial hypothalamus to paraventricular thalamus circuit that suppresses food intake. 2020, 11(1):6326.

8. Meek TH, Nelson JT, Matsen ME, Dorfman MD, Guyenet SJ, Damian V, Allison MB, Scarlett JM, Nguyen HT, Thaler JP et al: Functional identification of a neurocircuit regulating blood glucose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2016, 113(14):E2073-2082.