技术分享：心房特异性的AAV9递送系统
Tips：在上期“ODInCas9系统在临床前药物研发中的应用”技术分享中，我们介绍了Cas9调控表达的工具小鼠结合AAV9递送系统来进行NSCLC非小细胞肺癌的原位造模。本期将详细介绍AAV9的载体设计，从而实现心房特异性的基因递送。
腺相关病毒（Adeno-associatedvirus，AAV）是一种常用的工具病毒，被广泛用作生物医学和基因治疗研究中的基因递送载体[1]。AAV的血清型主要由AAV衣壳蛋白的结构所决定，不同的衣壳蛋白结构识别不同的细胞表面受体，因此不同血清型的AAV会影响其感染效率和组织亲和性等。其中AAV血清型9（AAV9）可以有效地感染心肌细胞，被认为是心脏基因递送的最有效血清型[2]。因此，通过AAV9来递送心房特异启动子驱动的基因表达，可以实现心房特异性的基因递送。
2019年1月，Circulation research上发表了一种心房特异性的AAV9递送系统，研究者选择心钠素（ANF）的启动子来驱动心房特异性表达[3]。ANF是一种在心房合成并储存的肽类激素，由Nppa基因编码。Nppa在发育的早期阶段表达在整个心脏，在出生后仅表达于心房中[4]。
研究者首先测试ANF启动子的特异性，以小鼠Nppa启动子的653bp片段作为心房特异性启动子[5]来驱动绿色荧光蛋白（GFP）的表达。将AAV9-ANF-GFP病毒（图一A）通过眼眶注射入成年C57BL/6J小鼠体内，3周后可以观察到GFP在心房的特异表达，并且荧光强度随着病毒剂量的增加而增强（图一B），而心室中不表达GFP（图一C-E）。对照结果中，心脏广谱表达的心肌肌钙蛋白T（TNT4）启动子驱动的AAV9-TNT4-GFP病毒的注射，可以观察到在心脏的四个腔室均表达GFP（图一C和E）。另外，全身性表达的鸡β-肌动蛋白（enCB）启动子驱动的AAV-enCB-GFP病毒，也同样观察到整个心脏的GFP表达（图一C）。
图一AAV9-ANF-GFP病毒高效介导体内心房特异性表达GFP[3]
接着，研究者利用AAV9-ANF-Cre病毒来介导体内心房特异性的基因重组（图二A），选择mT/mG双荧光报告小鼠来进行测试（图二B）。在mT/mG小鼠中表达Cre，使得细胞由原先表达tdTomato（mT）膜定位红色荧光蛋白，转变为mGFP（mG）膜定位绿色荧光蛋白（图二B）。将AAV9-ANF-Cre病毒注射入mT/mG小鼠体内后，仅在心房中检测到mGFP的表达，在心室或其他组织中没有检测到明显的mGFP阳性信号（图二C），并且心房内mGFP阳性细胞的数量表现为病毒剂量依赖性增加（图二D，E）。研究者进一步测试病理条件下的情况，在AAV9-ANF-Cre病毒注射一周后，对mT/mG小鼠进行横向主动脉缩窄（TAC）手术，TAC手术6周后进行检测。结果表明在病理条件下，AAV9-ANF-Cre病毒同样能高效完成心房特异性的基因重组（图二F，G）。
图二AAV9-ANF-Cre病毒高效介导体内心房特异性的基因重组[3]
最后，研究者利用AAV9-ANF-Cre病毒来介导体内心房特异性的基因敲降，选择shJPH2转基因小鼠[6]来进行测试（图三A）。在shJPH2小鼠中表达Cre，从而启动靶向Jph2基因的shRNA过表达，导致Jph2 mRNA表达量减少（图三A）。将AAV9-ANF-Cre病毒注射入shJPH2小鼠，4周后仅在心房组织中检测到JPH2蛋白表达的显著降低，在心室组织中没有改变（图三B-C）。而注射AAV9-TNT4-Cre病毒的shJPH2小鼠，在心房和心室组织中均能检测到JPH2蛋白的显著降低（图三D-E）。
图三AAV9-ANF-Cre病毒高效介导心房特异性的Jph2基因敲降[3]
综上所述，ANF启动子驱动表达的AAV9病毒可以结合各种工具小鼠，快速实现心房特异性基因过表达或敲降，从而加快心房相关疾病的科学研究，以及心房特异性基因治疗等转化研究。值得注意的是，AAV9的装载大小为4.7kb[7]，当表达外源大片段DNA超过该装载容量时，需要选择其他递送系统。
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参考文献
1. Gao GP, Alvira MR,Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM: Novel adeno-associated viruses fromrhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 2002, 99(18):11854-11859.
2. Bish LT, Morine K,Sleeper MM, Sanmiguel J, Wu D, Gao G, Wilson JM, Sweeney HL: Adeno-associatedvirus (AAV) serotype 9 provides global cardiac gene transfer superior to AAV1,AAV6, AAV7, and AAV8 in the mouse and rat. Hum Gene Ther 2008,19(12):1359-1368.
3. Ni L, Scott L,Campbell HM, Pan XL, Alsina KM, Reynolds J, Philippen LE, Hulsurkar M, LagorWR, Li N et al: Atrial-Specific Gene Delivery Using an Adeno-Associated ViralVector. Circ Res 2019, 124(2):256-262.
4. Small EA, Krieg PA:Transgenic analysis of the atrialnatriuretic factor (ANF) promoter: Nkx2-5 and GATA-4 binding sites are required for atrial specific expression of ANF. DevBiol 2003, 261(1):116-131.
5. Houweling AC, vanBorren MM, Moorman AFM, Christoffels VM: Expression and regulation of theatrial natriuretic factor encoding gene Nppa during development and disease.Cardiovasc Res 2005, 67(4):583-593.
6. van Oort RJ, GarbinoA, Wang W, Dixit SS, Landstrom AP, Gaur N, De Almeida AC, Skapura DG, Rudy Y,Burns AR et al: Disrupted Junctional Membrane Complexes and HyperactiveRyanodine Receptors After Acute Junctophilin Knockdown in Mice. Circulation 2011, 123(9):979-U123.
7. Wu ZJ, Yang HY, ColosiP: Effect of Genome Size on AAV Vector Packaging. Mol Ther 2010, 18(1):80-86.