技术分享：ODInCas9系统在临床前药物研发中的应用
Tips：在“新型调控sgRNA活性的CRISPR-Switch系统”技术分享中我们介绍了利用调控sgRNA来实现对CRISPR-Cas9系统的调控，本期将分享调控Cas9在临床前药物研发中的应用。另外，在上期“大片段DNA高效插入的基因编辑工具FiCAT”技术分享中我们介绍了一种结合CRISPR-Cas9和PiggyBac系统的新型基因编辑工具FiCAT，本期将分享利用ZFN来实现大片段DNA在基因组上的定点插入。
CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种高效的基因组编辑工具，是由人工设计的sgRNA识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶对靶向基因组DNA进行有效切割，形成DNA双链断裂，损伤后修复可造成基因敲除或敲入等，从而实现对基因组DNA的定向改造。2020年9月，Nature Communication上报道了一种ODInCas9（ObLiGaRe Doxycycline Inducible Cas9）系统，可在基因组上定点插入Tet-on Cas9元件，快速构建由强力霉素（Dox）诱导调控Cas9表达的工具细胞和工具小鼠，从而用于临床前的药物筛选与研究[1]。
研究者将Tet-on系统所需的两个调控元件TRE-Cas9-T2a-EmGFP和CAG-rtTA，与药筛元件PKG-Neo共同设计在一个质粒上，整个质粒共18 kb。其中，采用的是Tet-on 3G系统，并利用绝缘子Ins将TRE启动子元件与其他两个元件区隔开，使其更好地响应Dox的诱导，避免Tet-on系统的泄露（图一b）。研究者在前期工作中已开发了ObLiGaRe（Obligate Ligation-Gated Recombination）系统，利用基因编辑工具锌指核酸酶（ZFN）来介导大片段DNA（15 kb）的基因组定点插入，是由DNA损伤修复的非同源末端连接（NHEJ）来介导完成的[2]。因此，在本研究中同样选择ObLiGaRe系统来定点插入Tet-on Cas9的转基因元件ODInCas9，利用ZFN介导的靶位点双链DNA断裂来插入ODInCas9元件（图一b）。
确定好构建方案后，研究者首先构建ODInCas9工具细胞，分别在肝细胞HepG2、肾细胞HEK293、神经细胞N2a、肺细胞A549、结肠细胞HCT116、卵巢细胞OVCAR8和人诱导多能干细胞（hiPSC）中测试ODInCas9系统（图一a）。将ODInCas9质粒和ZFN靶向质粒（AAVS1或ROSA26位点）瞬转入细胞，1-2周后筛选出新霉素耐受的阳性细胞群；再利用流式分选单细胞到384孔板内，加入Dox进行Tet-on诱导，从而挑选出GFP阳性的单克隆细胞系。整个流程共计2-6周即可构建出ODInCas9细胞株（图一c）。ODInCas9细胞严格响应Dox的诱导表达，其中GFP指示Cas9的表达情况（图一d和e）；导入sgRNA后可检测到Cas9介导的高效靶向性切割（图一f）。
图一ODInCas9工具细胞的构建与测试[1]
随后研究者构建ODInCas9工具小鼠。首先，在小鼠胚胎干细胞（mESC）上的Rosa26位点进行打靶，获得的ODInCas9 mESC加Dox后可观察到GFP和Cas9的诱导表达（图二a和b）。然后，将ODInCas9 mESC进行囊胚注射，获得嵌合小鼠，再通过与野生型小鼠交配获得生殖系遗传的ODInCas9小鼠（图二c）。ODInCas9杂合小鼠喂食Dox 24 h后，可检测到各器官开始表达GFP（图二g）；喂食Dox 72 h后各器官的GFP表达增强（图二d和e）。ODInCas9纯合小鼠相较杂合小鼠的表达效果更佳（图二f和h）。对ODInCas9杂合小鼠进行Dox给药、撤药以及三周后再给药的处理，可检测到GFP表达的开启和关闭严格响应Dox的诱导（图二i）。值得注意的是，GFP在脑和睾丸的诱导表达量并不高。
图二ODInCas9工具小鼠的构建与测试[1]
研究者进一步测试ODInCas9工具小鼠的基因编辑能力。利用尾静脉注射AAV9来递送靶向Trp53的sgRNA（图二j，上图），小鼠喂食Dox后可在肝脏中检测到Cas9介导的高效靶向性切割（图二k）。另外，将ODInCas9小鼠与肝脏过表达人源hPCSK9的高胆固醇血症小鼠进行杂交，利用尾静脉注射脂质纳米颗粒（LNP）来递送靶向PCSK9的sgRNA（图二j，下图），小鼠喂食Dox后可在肝脏中检测到Cas9介导的PCSK9高效切割，进而显著性降低20%的血浆甘油三酯水平（图二l和m）。以上结果表明在ODInCas9工具小鼠中，Cas9的表达严格响应Dox的诱导调控，没有出现系统泄露。
接着，研究者利用ODInCas9工具小鼠来进行复杂基因型的肿瘤模型造模，模拟KrasG12D;Trp53−/−，KrasG12C;Trp53−/− 和KrasG12D;Stk11−/−三种基因型的非小细胞肺癌（NSCLC）模型。研究者选择AAV9递送系统来进行造模，AAV载体包含靶向Kras，Trp53/ Stk11的sgRNA，以及KrasG12C/D点突变的同源修复打靶序列（HDR template）。ODInCas9小鼠喂食Dox三天后，将AAV9采用口咽抽吸法经咽部注入气管，再喂食Dox一天后撤药，观察NSCLC的发生发展（图三a）。ODInCas9小鼠在AAV9造模3周后开始出现Ⅰ级和Ⅱ级支气管肺泡腺瘤，并逐步发展至Ⅲ级和Ⅳ级腺瘤（图三b）。在NSCLC造模的肿瘤建系细胞（图三c）和原位肿瘤（图三d和e）中都能检测到Trp53和Stk11的KO，以及KrasG12C/D点突变的正确基因型（图三e和f）。以上结果表明ODInCas9工具小鼠结合AAV高效递送系统，可以快速构建复杂基因型的原位肿瘤模型。
图三 ODInCas9工具小鼠的非小细胞肺癌造模[1]
最后，研究者利用ODInCas9小鼠的原位NSCLC模型，来进行临床前体内药效评价。在ODInCas9小鼠上利用AAV9递送KrasG12D;Trp53−/−基因型造模4周后，开始进行2周的紫杉醇和司美替尼（AZD6244，MEK抑制剂）联合治疗（图四a），可观察到联合治疗组能有效阻滞肿瘤进展，并显著降低肿瘤的肺占位比例（图四b-f）。
图四 利用ODInCas9小鼠的原位NSCLC模型进行临床前体内药效评价[1]
综上所述，ODInCas9系统提供了一个短时高效、可重复的精准调控基因工程开发平台。可快速构建ODInCas9工具细胞系（2周），并进行基因KO等，用于疾病靶标的筛选和验证。此外，ODInCas9工具小鼠结合AAV高效递送系统，可快速便捷地构建多种复杂基因型的原位肿瘤模型，降低研发时间与成本，广泛应用于临床前的药效评价与研究。
GTP研发中心已制备完成Gt(ROSA)26Sortm3(tetO-Flag-Cas9)小鼠（GTP ID: G-21000010），在安全位点Gt(ROSA)26Sor中敲入tetO-Flag-Cas9元件（图五）。该小鼠与组织特异的rtTA小鼠交配后，喂食Dox可实现时空特异的Tet-On诱导Flag-Cas9的表达，其中Flag标签蛋白可指示Cas9的过表达情况与蛋白定位。该小鼠同样采用Tet-on 3G系统，并利用绝缘子Ins将TRE启动子元件区隔开，可有效避免Tet-on系统的泄露。
图五 GTP研发中心的Gt(ROSA)26Sortm3(tetO-Flag-Cas9)小鼠构建策略
GTP研发中心拥有自主知识产权的“人造精子细胞”介导的半克隆技术，可在体外实现“人造精子细胞”的多位点改造并进行功能元件测试，最后将“人造精子细胞”通过卵母细胞注射可以一步法获得基因改造小鼠。基于“人造精子细胞”单倍体打靶高效率的优势，可快速构建定制化小鼠，如基因组安全位点大片段敲入、条件性基因敲除/敲入和人源化基因改造等。多个调控元件可以通过多次体外细胞打靶构建在同一株“人造精子细胞”中，经细胞水平质控后，一步法获得基因改造小鼠。
如有需要欢迎联系我们，GTP研发中心将竭诚为您设计最佳方案，制定专属于您的基因改造小鼠。
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参考文献
1. Lundin A, Porritt MJ, Jaiswal H, Seeliger F, Maresca M: Development of an ObLiGaRe Doxycycline Inducible Cas9 system for pre-clinical cancer drug discovery. Nature Communications 2020, 11(1).
2. Maresca M, Lin VG, Guo N, Yang Y: Obligate Ligation-Gated Recombination (ObLiGaRe): Custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome research 2013, 23(3):539-546.