技术分享：光遗传学红光/远红光精准调控新工具的开发与应用
Tips：在前期技术分享“远红外诱导调控的分割型Cre-loxP重组酶系统”中，我们介绍了利用光敏蛋白BphS系统的改进与应用；在“蓝光诱导调控的Cre-loxP重组酶系统的开发与升级”中，我们介绍了利用Magnet系统的开发与升级，该系统是由光敏蛋白VVD系统改造而来。
近年来光遗传学技术发展迅速，许多自然存在的光敏蛋白如CRY2，FKF1，VVD，EL222， PhyB，BphP1和BphS等被开发成光遗传学技术，用于基础科研以及生物医药转化研究中的精准时空调控。2021年10月，华东师范大学的叶海峰研究组在Nature Biotechnology上报道了一种基于植物光敏色素PhyA改进的新型REDMAP（red/far-red light-mediated and miniaturized Δphytochrome A (ΔPhyA)-based photoswitch）系统[1]。该系统具有模块小、灵敏度高、可逆性强的特点，为基础科研以及生物医药转化研究提供了强有力的光遗传学新工具。
植物光敏色素PhyA通过共价结合发色团藻青素（PCB）可响应红光（660 nm）和远红光（730 nm）的调控[2, 3]，在与穿梭蛋白FHY1结合后可进入细胞核中[4, 5]。PhyA与FHY1可在红光（660 nm）作用下诱导结合，并且在远红光（730 nm）作用下解离（图一a）。基于该系统的优势，研究者在其基础上进行改进，并设计了报告基因系统来评价光控诱导效率。将PhyA与转录激活蛋白Gal4融合，利用Gal4-UAS系统激活报告系统中分泌型胎盘碱性磷酸酶（SEAP）的表达。当PhyA与FHY1结合后入核，SEAP的表达被开启（图一b）。利用该报告基因系统，研究者筛选出截短型ΔPhyA-Gal4（PhyA, 1-617 aa）（图一c）、穿梭蛋白FHY1（图一d）以及FHY1-VP64融合蛋白形式（图一e）的光控诱导效率最高。在PCB存在下，ΔPhyA-Gal4与FHY1-VP64组合的光控诱导效率高达到150倍以上（图一f），从而确定了REDMAP系统的表达元件。
图一 REDMAP系统工作原理示意图及其优化[1]
REDMAP系统可以与CRISPR–dCas9 SAM激活系统[6]相结合开发成REDMAPcas系统。在红光（660 nm）照射下，该系统的ΔPhyA与FHY1结合后入核，Gal4-UAS系统激活MS2-p65-HSF1的表达，进而在同时过表达dCas9和sgRNA的条件下开启CRISPR–dCas9 SAM激活系统，实现对靶基因的激活表达（图二右图）。在远红光（730 nm）作用下，MS2-p65-HSF1的表达被关闭，从而关闭CRISPR–dCas9 SAM激活系统（图二左图）。
图二 REDMAPcas系统工作原理示意图[1]
由于REDMAP系统的质粒PhCMV-ΔPhyA-Gal4-P2A-FHY1-VP64-pA较小，即模块小，便于包装在一个AAV载体中。将REDMAP AAV与UAS-luciferase报告系统AAV混合后，通过尾静脉注射到小鼠体内，在AAV注射后的2~11周观察期中，光照前小鼠腹腔注射PCB，仅用1分钟的红光（660 nm）照射即可高效诱导小鼠体内荧光素酶报告基因的表达（图三）。以上小鼠体内数据结果进一步证明了REDMAP系统的光响应速度快，并且AAV包装系统的简便性可更好地运用于基因治疗等领域的体内精准调控。
图三 AAV介导REDMAP系统在小鼠体内的光控应用[1]
基于REDMAP系统灵敏度高、红光/远红光组织穿透性强的优势，研究者进一步将其应用到体内疾病治疗模型中，选择的是Ⅰ型糖尿病（T1D）模型。研究者将ΔPhyA–Gal4，FHY1–VP64，PCB产生质粒以及驱动胰岛素表达P5×UAS-SEAP-P2A-insulin-pA的四个表达载体，稳转入HEK293细胞（图四a右图），并将工程细胞微胶囊皮下注射至T1D小鼠模型背部（图四a左图）。在每天5秒的红光（660 nm）照射下，2天后可检测到T1D小鼠模型的血液胰岛素含量显著升高（图四b），血糖含量显著降低（图四c），并且在小鼠糖耐受实验中也能有效改善糖代谢能力（图四d）。REDMAP系统在T1D大鼠模型体内也能观察到同样的降血糖效果，仅将红光（660 nm）照射时间调整为每天2次，每次5分钟。
图四 REDMAP系统在T1D小鼠模型中维持葡萄糖稳态的应用[1]
综上所述，REDMAP系统具有模块小、灵敏度高、可逆性强的特点，并且红光/远红光的组织穿透性强，可广泛应用于在体研究，简化并提高基因治疗和细胞治疗的精准调控，推进光遗传技术在基础科研以及生物医药转化研究的应用。
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参考文献
1. Zhou Y, Kong DQ, Wang XY, Yu GL, Wu X, Guan NZ, Weber W, Ye HF: A small and highly sensitive red/far-red optogenetic switch for applications in mammals. Nat Biotechnol 2021.
2. Jorissen HJMM, Quest B, Lindner I, de Marsac NT, Gartner W: Phytochromes with noncovalently bound chromophores: The ability of apophytochromes to direct tetrapyrrole photoisomerization. Photochem Photobiol 2002, 75(5):554-559.
3. Kami C, Mukougawa K, Muramoto T, Yokota A, Shinomura T, Lagarias JC, Kohchi TJPotNAoSotUSoA: Complementation of phytochrome chromophore-deficient Arabidopsis by expression of phycocyanobilin:ferredoxin oxidoreductase. 2004, 101(4):1099-1104.
4. Possart A, Hiltbrunner A: An evolutionarily conserved signaling mechanism mediates far-red light responses in land plants. The Plant cell 2013, 25(1):102-114.
5. Rausenberger J, Tscheuschler A, Nordmeier W, Wust F, Timmer J, Schafer E, Fleck C, Hiltbrunner A: Photoconversion and Nuclear Trafficking Cycles Determine Phytochrome A's Response Profile to Far-Red Light. Cell 2011, 146(5):813-825.
6. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H et al: Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 2015, 517(7536):583-588.