技术分享：远红外诱导调控的分割型Cre-loxP重组酶系统
Cre-loxP重组酶系统是一种位点特异的基因重组技术，在条件性基因失活或敲除、基因激活、颠换与移位等方面应用广泛。近年来，科学家们开发了一系列基于小分子化合物如四环素[1]、他莫昔芬[2]和雷帕霉素[3]等诱导的Cre-loxP重组酶系统，以实现基因组工程上的时间调控。然而这些系统仍存在一定的局限性，如细胞毒性、泄露和脱靶等。光遗传学的发展改变了以往研究细胞活动和功能的方式，开启了时空调控模式。目前用于Cre-loxP重组酶系统的光诱导技术主要是基于紫外光UV[4]或蓝光[5]的方法，但两者的组织穿透力较弱，另外还存在光毒性和重组效率低等问题，从而限制了Cre-loxP光诱导重组系统在动物体内的应用。
2020年7月，由华东师范大学生命科学学院的叶海峰研究组开发了一种新型远红外诱导调控的分割型Cre-loxP重组酶系统，即FISC（far-red light-induced split Cre-loxP system）系统，可利用远红光（FRL，730 nm）实现体内精准调控的基因重组[6]。在FISC系统中，Cre重组酶被分成两个片段（图一），其中CreN（残基1-59）与Coh2融合，由hCMV启动子驱动；CreC（残基60-343）与DocS融合，由FRLx启动子驱动。如图二所示，CreN-Coh2为持续性表达。在FRL的作用下，光感受器BphS能将细胞内的三磷酸鸟苷酸（GTP）转化为环二鸟苷酸单磷酸盐（c-di-GMP），随后触发反式激活子FRTA（p65-VP64-BldD）的二聚化，进而与FRLx启动子结合，激活DocS-CreC的表达。基于Coh2和DocS结构域的强亲和力，当两个片段结合在一起时，Cre重组酶的催化活性被激活[7]，进而识别loxP位点切除STOP序列，从而启动目的基因的表达。
图一 FISC系统的质粒元件示意图[6]
图二 FISC系统的工作原理示意图[6]
为更好实现该系统在体内的表达，鉴于AAV病毒载体表达容量的限制，研究人员将FISC系统重新分布在3个AAV病毒表达载体上（图三a），并利用尾静脉注射的方法将三种FISC系统的AAV病毒导入tdTomato转基因报告小鼠中（图三b和三c）。经过FRL照射后，小鼠被照射的区域显示出高效诱导表达tdTomato红色荧光蛋白的信号（图三d-j）。
图三 利用AAV病毒将FISC系统递送到tdTomato转基因报告小鼠中介导DNA重组[6]
综上所述，FISC系统相比蓝光系统有更优的组织穿透力，并且基本检测不到光细胞毒性。该系统为组织异种移植中的光学控制，敲入和敲除突变体的产生，以及诱导多能干细胞等领域提供了新思路。
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参考文献
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2. Schwenk F, Kuhn R, Angrand PO, Rajewsky K, Stewart AF: Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Res 1998, 26(6):1427-1432.
3. Jullien N, Sampieri F, Enjalbert A, Herman JP: Regulation of Cre recombinase by ligand-induced complementation of inactive fragments. Nucleic Acids Res 2003, 31(21):e131.
4. Inlay MA, Choe V, Bharathi S, Fernhoff NB, Baker JR, Jr., Weissman IL, Choi SK: Synthesis of a photocaged tamoxifen for light-dependent activation of Cre-ER recombinase-driven gene modification. Chemical communications 2013, 49(43):4971-4973.
5. Taslimi A, Zoltowski B, Miranda JG, Pathak GP, Hughes RM, Tucker CL: Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology 2016, 12(6):425-430.
6. Wu J, Wang M, Yang X, Yi C, Jiang J, Yu Y, Ye H: A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice. Nat Commun 2020, 11(1):3708.
7. Barak Y, Handelsman T, Nakar D, Mechaly A, Lamed R, Shoham Y, Bayer EA: Matching fusion protein systems for affinity analysis of two interacting families of proteins: the cohesin-dockerin interaction. Journal of molecular recognition : JMR 2005, 18(6):491-501.