技术分享：蓝光诱导调控的Cre-loxP重组酶系统的开发与升级

Tips：在第一期技术分享“远红外诱导调控的分割型Cre-loxP重组酶系统”中，我们介绍了远红外光诱导调控的Cre-loxP重组酶系统，本期将介绍蓝光诱导调控的Cre-loxP重组酶系统。

以Cre-loxP重组系统为代表的基因工程技术已广泛应用于生物医学研究。条件性诱导激活Cre-loxP重组酶系统的方式主要分为化学诱导和光遗传学诱导方法，不同方法优缺点各异，科学家们也在不断对其进行改进。在光遗传学系统中，2016年一篇Nature Chemical Biology文章介绍了一种PA-Cre（photoactivatable Cre recombinase）系统，利用蓝光诱导Magnet系统的二聚化来组装分割型Cre，从而激活Cre重组酶（图一）。在低强度蓝光照明（~0.04 W m-2）或短周期脉冲照明（~30 s）下也能够快速诱导DNA重组[1]

PA-Cre系统所需的Magnet系统包含正磁体（pMag）和负磁体（nMag）两种光控开关，是从真菌光感受器VVD改造而来的基于静电相互作用的异源二聚体光开关，可有效避免同源二聚体的形成（图二）[2]。而另一组分Cre重组酶被分为CreN59（残基19–59）和CreC60（残基60–343）两个片段，其中CreN59与nMag-NLS连接形成CreN59-nMag-NLS融合蛋白质，CreC60与NLS-pMag连接形成NLS-pMag-CreC60融合蛋白质（图一a，左图）。在无蓝光照射的条件下，由于Cre重组酶被分割而呈非活性PA-Cre状态，对loxP位点没有催化活性。当蓝光照射后，介导pMag和nMag的二聚化，继而诱导CreN59与CreC60结合，恢复PA-Cre的催化活性，从而识别loxP位点发生DNA序列重组（图一a，右图）。该系统可构建在一个表达载体PCMV-CreN59-nMag-NLS-P2A-NLS-pMag-CreC60中，利用P2A来区隔（图一b）。

图一 蓝光诱导的PA-Cre系统的工作原理示意图[1]

图二 Magnet系统的工作原理示意图[2]

2020年研究者进一步改进系统，升级为PA-Cre 3.0，该系统大大减少了在黑暗及自然光下的Cre重组酶泄露，文章发表在Nature Communications上[3]。研究者发现之前的设计质粒中（图一b），由于P2A的切割不完全，残留的全长蛋白导致PA-Cre系统泄露。因此研究者通过优化密码子（图三a），并将CMV启动子换成CAG启动子，即PA-Cre 3.0，可有效减少全长蛋白的存在（图三b）。在体外荧光素酶报告系统，PA-Cre 3.0也表现出低背景、高诱导效率的优势（图三c）。将PA-Cre 3.0与原PA-Cre质粒利用高压水动力法尾静脉注射入Rosa26^Ai14/WT 杂合报告基因小鼠体内（Ai14：Floxed-tdTomato），检测小鼠肝脏可见PA-Cre 3.0大大减少了在黑暗及自然光下的Cre重组酶泄露（图三d，白色箭头指示红光泄露细胞）

图三 PA-Cre 3.0的优化设计与效率对比[3]

为证明PA-Cre 3.0在小鼠体内的有效性，研究者在小鼠胚胎干细胞中（mESCs）将Rosa26-CAG-FRT-Stop-FRT-PA-Cre 3.0序列敲入Rosa26位点（图四a），并进行囊胚注射获得嵌合小鼠，通过与野生型小鼠交配获得生殖系遗传的PA-Cre 3.0 B4小鼠。PA-Cre 3.0 B4小鼠再与Rosa26^Ai14/Ai14报告基因小鼠交配，从获得的双阳性子代胚胎中分离出小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）用于后续检测实验。在MEFs细胞中，利用慢病毒导入Flp重组酶，并给予蓝光诱导后，可见红色荧光蛋白的诱导表达，并且系统没有泄露（图四b）。另外，将Flp重组酶质粒利用高压水动力法尾静脉注射入PA-Cre 3.0 B4:Ai14小鼠体内，检测小鼠肝脏可见只有在蓝光照射下特异性诱导红色荧光蛋白的高表达（图四c）。

图四 在PA-Cre3.0 B4小鼠体内进行蓝光诱导效率检测[3]

综上所述，PA-Cre系统可利用蓝光照射在活体小鼠的内部器官中高效诱导DNA重组，并且升级版PA-Cre 3.0系统大大的减少了黑暗及自然光下的Cre重组酶泄露。PA-Cre 3.0系统提供了一个强大的工具，极大地促进体内光遗传基因组工程，进一步促进生物学和生物医学研究。

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参考文献

1. Kawano F, Okazaki R, Yazawa M, Sato M: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nature chemical biology 2016, 12(12):1059-1064.

2. Kawano F, Suzuki H, Furuya A, Sato M: Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nature communications 2015, 6:6256.

3. Morikawa K, Furuhashi K, de Sena-Tomas C, Garcia-Garcia AL, Bekdash R, Klein AD, Gallerani N, Yamamoto HE, Park SE, Collins GS et al: Photoactivatable Cre recombinase 3.0 for in vivo mouse applications. Nature communications 2020, 11(1):2141.