技术分享：全基因组CRISPRa激活筛选发现脯氨酸代谢酶PRODH2可增强CAR-T疗效
Tips：在“CRISPRa和CRISPRi的人原代T细胞筛选系统”技术分享中，我们介绍了CRISPRa激活系统和CRISPRi抑制系统的原理，及其应用于人原代T细胞的大规模筛选，以获得细胞治疗新靶点。本期我们将介绍利用CRISPRa激活系统进行小鼠原代T细胞的全基因组筛选，鉴定并证明了PRODH2新靶点可增强CAR-T疗法的治疗效果。
T细胞是适应性免疫的基石，是维持人类健康的重要角色。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法已在治疗癌症和免疫疾病方面取得了巨大进展[1, 2]。然而，目前CAR-T疗法仍然面临多种挑战，例如抗原丢失、靶标识别失败、癌症免疫逃逸和持久性不足等[3, 4]。因此，寻找可增强CD8+ T细胞效应功能的靶点基因，将其应用于工程化改造T细胞，可为T细胞治疗带来广泛的应用前景和疗效受益。
2022年4月，Cell Metabolism上报道了一种基于dead-guide RNA（dgRNA）CRISPRa激活系统的功能增益（gain-of-function，GOF）筛选方法，用于原代CD8+ T细胞的高通量筛选，以获得增强T细胞效应功能的GOF靶点。利用该筛选方法，研究者获得了多个GOF靶点，并鉴定了脯氨酸脱氢酶2（PRODH2）可通过重塑原代CD8+ T细胞以及CAR-T细胞的代谢途径和基因表达谱式，显著性提高T细胞的杀伤功能，增强CAR-T细胞的体内外抗肿瘤效果[5]。
首先，研究者构建了慢病毒T细胞dgRNA激活（TdgA）载体 (图一A)，并针对小鼠mm10基因组所有注释蛋白质的启动子序列，设计了全基因组的dgRNA文库（mm10dgLib）（图一B）。经过筛选，最终mm10dgLib包含有靶向22,391个编码转录本和1,000个非靶向对照（NTC）的共计84,601个dgRNAs，它们被合成克隆到TdgA载体中（图一B）。研究者将这些mm10dgLib质粒库包装成慢病毒，并且质控确认已达到足够的病毒滴度用于下游的CRISPRa系统筛选。
图一 基于dgRNA的CRISPRa系统筛选出增强CD8+ T细胞效应功能的靶点[5]
脱颗粒是细胞毒性CD8+ T淋巴细胞（CTL）介导靶细胞杀伤的主要机制之一[6]，CD107a（也称为LAMP-1）是其标记物，可在脱颗粒后出现于细胞表面[7]。为了鉴定出能够增强CD8+ T细胞脱颗粒能力的靶点基因，研究者利用基于mm10dgLib的CRISPRa系统进行CD8+ T细胞杀伤试验筛选（dgTKS），将来源于OT-I;Cas9β小鼠的CD8+ T细胞与提呈SIINFEKL肽的E0771乳腺癌细胞共培养（图一C）。结果显示，与对照组相比，mm10dgLib慢病毒转导的CD8+ T细胞在共培养后CD107a水平显著升高（图一D和E）。研究者利用FACS分选出前5%高表达CD107a的CD8+ T细胞，测序鉴定出富集的dgRNA序列（图一C），共获得靶向Prodh2、Srek1ip1、Wdr37、Ccnb1ip1、Pbxip1和Sdhaf2在内的26个GOF靶点（图一F）。进一步验证了其中4个靶点，发现PRODH2、CCNB1IP1、SREK1IP1、WDR37的过表达都能显著提高CD8+ T细胞的脱颗粒能力（图一G）；并且PRODH2过表达还显著促进了CD8+ T细胞的增殖（图一H）。以上数据表明，基于dgRNA的CRISPRa系统可以用于快速筛选增强CD8+ T细胞效应功能的潜在GOF靶点。
为了验证PRODH2对CD8+ T细胞的GOF作用，研究者构建了特异性靶向TRAC位点的AAV-CD22-CAR-T2A-PRODH2，使得CD22-CAR和PRODH2在人原代T细胞中同时过表达，并构建了AAV-CD22-CAR-T2A-PRODH2 (Stop)作为对照（图二A）。FACS结果显示，AAV递送稳定敲入人原代CD8+ T细胞，并成功分选富集了CD22-CAR-T细胞（图二B），免疫印迹结果证明了PRODH2的同时过表达（图二C）。通过FACS检测细胞增殖标志物Ki-67，发现Ki-67的表达水平在PRODH2过表达的CAR-T细胞中显著上升(图二D)。细胞共培养实验显示，PRODH2过表达的CAR-T细胞相比对照组具有更强的靶细胞杀伤能力（图二E）。类似地，研究者构建了另一个过表达PRODH2的HER2-CAR-T细胞（图二F），同样显示PRODH2过表达使得CAR-T细胞具有更强的靶细胞杀伤能力（图二G）。此外，研究者使用慢病毒分别构建了PRODH2过表达的CD22-CAR-T和BCMA-CAR-T细胞（图二H和J），再次证明PRODH2过表达显著增强了CAR-T细胞的杀伤能力（图二I和K），其中PRODH2对BCMA-CAR-T细胞的增强效果更为明显（图二K）。以上数据表明，在多种CAR-T细胞模型中，过表达PRODH2的GOF作用可增强抗原特异性CAR-T细胞的体外杀伤能力。
图二 PRODH2过表达可显著性增强CAR-T细胞的体外杀伤能力[5]
接着，研究者进一步测试PRODH2的GOF作用能否提高CAR-T细胞的体内治疗效果。首先测试了CD22阳性的B细胞白血病模型（图三A），结果显示，对照组CD22-CAR-T细胞虽然具有抗肿瘤活性，但白血病很快又会复发；而PRODH2过表达组显示出更卓越的抗肿瘤活性，可以有效控制白血病进展（图三B和C）。研究者还使用AAV和慢病毒两种不同递送方法的CAR-T平台，在系统性多发性骨髓瘤模型中进行测试（图三D）。AAV递送系统的总生存期分析显示，对照组BCMA-CAR-T细胞略微延长了小鼠总体生存期，而PRODH2过表达组具有更优的体内治疗效果，显著提高了总体生存期（图三E和F）。慢病毒递送系统的结果显示，PRODH2过表达增强了BCMA-CAR-T细胞的抗肿瘤效果（图三G和H）。以上数据表明，在多种小鼠肿瘤模型中，过表达PRODH2显著增强了CAR-T细胞的抗肿瘤在体治疗效果，且对BCMA-CAR-T细胞疗法的增益效果更为显著。
图三 PRODH2过表达可增强小鼠肿瘤模型的CAR-T细胞疗效[5]
下一步，研究者利用多组学分析对PRODH2的GOF分子机制进行研究，发现PRODH2的过表达重塑了以细胞周期、T细胞活化和代谢过程为核心的CD22-CAR-T细胞的基因表达谱式和免疫效应功能。PRODH2编码的脯氨酸脱氢酶，可以催化4-羟基脯氨酸（4Hyp）转化为1-吡咯啉-3-羟基-5-羧酸盐（PHC），这是脯氨酸代谢途径的关键步骤[8]。通常情况下，PRODH2在大多数人体器官和细胞中的表达水平较低，包括原代CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。最后，研究者对CAR-T细胞进行了代谢组学分析，共鉴定出75种代谢产物，其中8种在PRODH2过表达CAR-T细胞中表达更加丰富，而有19种被显著下调（图四A和B）。PRODH2的催化底物4Hyp和产物PHC也分别被检测到相应的下调与上调表达（图四A和B）。L-脯氨酸在P4HA1或P4HA2的催化下可产生4Hyp，进而被PRODH2催化成PHC（图四C）。研究者采用脯氨酸代谢相关底物或抑制剂预处理CAR-T细胞3-6天，然后进行共培养和流式测定实验（图四C和D），并确认了实验细胞中高效的CAR敲入（图四E）。结果显示，L-脯氨酸和4Hyp的添加仅显著增强了PRODH2过表达CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力（图四F）；而P4HA1和P4HA2的抑制剂1,4-DPCA也仅降低了PRODH2过表达CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力，且对T细胞活力没有影响（图四G）；PRODH2过表达后IFNg表达水平上调，且高浓度1,4-DPCA的添加可显著抑制IFNg的表达使其接近对照组细胞水平（图四H和I）。此外，PRODH2的代谢产物PHC是由GOT1/2转运，添加GOT1/2抑制剂PF04859989同样仅降低了PRODH2过表达CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力（图四J）。以上脯氨酸代谢途径的扰动实验结果表明，PRODH2过表达对CAR-T细胞的功能增益机制是由其脯氨酸代谢酶的功能发挥作用的。
图四 PRODH2过表达CAR-T细胞的代谢组学分析和生化免疫学验证[5]
综上所述，研究者开发的基于dgRNA的全基因组CRISPRa激活筛选方法，可以高通量筛选获得增强CAR-T细胞效应功能的GOF新靶点，进而鉴定并验证了GOF新靶点PRODH2通过其脯氨酸代谢酶功能，重塑了CD8+ T细胞和CAR-T细胞中的转录组、代谢组以及免疫功能，增强了CAR-T细胞的体内外抗肿瘤效果。该研究为进一步提高CAR-T疗法的治疗效果提供了新的靶点，不仅增加了CAR-T疗法的治疗疾病种类，还能拓展到其他以T细胞为核心的细胞免疫疗法中，具有广泛的临床意义。
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参考文献
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