技术分享：CRISPRa和CRISPRi的人原代T细胞筛选系统
Tips：在上期“基于CRISPRa-SAM小鼠的疾病造模方法”技术分享中，我们介绍了CRISPRa激活系统以及利用CRISPRa-SAM小鼠来进行多种疾病造模。本期我们将介绍利用CRISPRa激活系统和CRISPRi干扰系统来进行人原代T细胞的大规模筛选，以获得细胞治疗新靶点。
调节性T细胞受刺激后分泌的细胞因子是平衡免疫反应的关键。细胞因子的失调可导致自身免疫性疾病、免疫缺陷和癌症[1-3]。全面了解调控人原代T细胞产生细胞因子的通路将有助于开发新一代免疫疗法，也将为了解相关疾病机制提供更多依据。
CRISPR作为强大的基因编辑工具，其衍生的CRISPR-KO高效筛选系统已广泛应用于全基因组范围的功能缺失研究中。CRISPRa激活系统和CRISPRi干扰系统是通过调控靶基因转录的激活或沉默，来实现功能获得或功能缺失。由于是对靶基因的转录调控，CRISPRa和CRISPRi系统要发挥作用需要持续表达dCas9，这就限制了这两个系统在原代细胞中的大规模筛选应用。
2022年2月，Science上报道了一种可用于人原代T细胞进行大规模CRISPRa和CRISPRi筛选的平台，研究者优化了高滴度慢病毒的生产方法，使得人原代T细胞的病毒转导效率高达80%，突破了之前的技术瓶颈。并且，利用这两个系统发现了一群新的调控因子，可刺激依赖性地调控人原代T细胞分泌细胞因子[4]。
研究者首先优化CRISPRa和CRISPRi系统的原代细胞转导条件，通过优化高滴度慢病毒载体的生产方法同时递送最小的dCas9-VP64质粒，使得病毒转导效率高达80%。研究者采用CRISPRa-SAM激活系统来进行全基因组的激活表达筛选，在人原代T细胞上先后感染dCas9-VP64慢病毒和sgRNA慢病毒文库，其中后者包含超过112,000个sgRNAs共靶向18,800余个靶基因。阳性筛选结果是利用流式细胞仪来分选CD4+ T细胞中IL-2高表达或CD8+ T细胞中IFN-γ高表达的细胞，并经测序确定被激活的靶基因（图一A）。sgRNA靶向IL2和IFNG的阳性对照在各自的筛选结果中被富集，而非靶向的阴性对照没有被富集（图一B），表明筛选系统真实可靠。CRISPRa系统的CD4+ IL-2hi和CD8+ IFN-γhi两个筛选结果分别获得444个和471个靶基因，其中交集为171个靶基因（图一C-E）。两个筛选结果在不同人的T细胞中都有高度重复性（图一C和D）。
图一 人原代T细胞的全基因组CRISPRa筛选[4]
同理，研究者进行CRISPRi筛选，CD4+ IL-2hi和CD8+ IFN-γhi两个筛选结果分别获得226个和203个靶基因，其中交集为92个靶基因。在不同人T细胞中，两个筛选结果同样有高度重复性（图二A和B）。值得注意的是，CRISPRi系统筛选得到的靶基因通常是原本高表达的基因，而CRISPRa系统得到的往往是原本低表达的基因（图二C-E）。因此，CRISPRa和CRISPRi两个筛选系统的结果相互补充，能更全面地发现功能性调控因子。举个例子，通过CRISPRi筛选得知可通过抑制T细胞刺激信号MALT1、BCL10、TRAF6和TAK1，来抑制NF-κB复合物，从而促进IFN-γ的分泌。另外，通过CRISPRa筛选得知可通过激活肿瘤坏死因子超家族受体，来抑制NF-κB复合物，促进IFN-γ的分泌（图二E和F）。从而全面获得针对NF-κB复合物的正、反调控因子，共同起到促进IFN-γ分泌的作用。
图二 人原代T细胞的全基因组CRISPRi筛选[4]
最后，为了评价每个CRISPRa基因激活后产生的整体分子特征，研究者将CRISPRa与单细胞测序scRNA-seq相结合开发了CRISPRa Perturb-seq平台。将一个直接捕获序列整合到CRISPRa-SAM系统的sgRNA支架上，以实现与scRNA-seq方法的测序兼容性（图三A）。研究者使用CRISPRa Perturb-seq平台激活70个靶基因，并对约56,000个人原代T细胞进行scRNA-seq（图三B），揭示了不同调控因子激活T细胞产生不同细胞因子的过程。
图三 CRISPRa Perturb-seq平台的工作原理[4]
综上所述，利用CRISPRa激活系统和CRISPRi干扰系统可进行人原代Ｔ细胞的大规模筛选，功能获得和功能缺失的筛选结果可以相互补充，获得全面的功能性调控因子。进一步细化研究可得到T细胞的关键调控因子，有望成为新一代细胞治疗靶点，用于增强T细胞的肿瘤杀伤能力。
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参考文献：
1. Abbas AK, Trotta E, Simeonov DR, Marson A, Bluestone JA: Revisiting IL-2: Biology and therapeutic prospects. Sci Immunol 2018, 3(25).
2. Ni L, Lu J: Interferon gamma in cancer immunotherapy. Cancer Med-Us 2018, 7(9):4509-4516.
3. Ivashkiv LB: IFN gamma: signalling, epigenetics and roles in immunity, metabolism, disease and cancer immunotherapy. Nature Reviews Immunology 2018, 18(9):545-558.
4. Schmidt R, Steinhart Z, Layeghi M, Freimer JW, Bueno R, Nguyen VQ, Blaeschke F, Ye CJ, Marson A: CRISPR activation and interference screens decode stimulation responses in primary human T cells. Science 2022, 375(6580):eabj4008.
