技术分享：氟达拉滨可增强AAV递送的同源重组效率
Tips：在“大片段DNA高效插入的基因编辑工具FiCAT”技术分享中，我们介绍了新型基因编辑工具FiCAT可增强大片段DNA的插入效率，使其更加精准高效地运用于基因治疗等领域。本期我们将分享已上市药物氟达拉滨的新功能，短暂氟达拉滨给药可提高AAV递送的同源重组效率，帮助实现终身治疗性基因补偿。
腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）是一种常用的工具病毒，被广泛用作生物医学和基因治疗研究中的基因递送载体[1]。相比慢病毒（LV）基因递送系统，AAV在基因组中随机整合的风险较低，安全性更高。可是，当基因治疗所需的基因补偿需要长期维持时，仍然需要将AAV所携带的治疗元件安全插入基因组中，使其可以长期发挥作用。2015年，有研究者开发了一种基于无启动子AAV的基因打靶策略，称为“GeneRide”或AAV-HR，已成功实现在人类疾病动物模型中的永久性基因校正[2]。该技术是将所需治疗元件插入到某个内源蛋白基因组的终止密码前，并添加自切割肽（P2A）将治疗蛋白与内源蛋白相隔开，实现在内源蛋白启动子的作用下同时表达内源蛋白和治疗蛋白。AAV-HR技术是在无核酸酶的存在下，利用细胞自身的同源修复（HR）机制完成基因敲入（KI），因而成功KI的整体效率很低。可是，该方法由于AAV中的治疗元件并不携带启动子，即使随机插入到基因组其他位点上，也不容易造成插入位点附近基因（包括癌基因）的非预期激活，安全性更高。
为了进一步提高AAV-HR技术的效率，研究者筛选了一系列小分子化合物，发现氟达拉滨可以通过瞬时诱导DNA损伤信号来提高AAV-HR技术在小鼠体内成功KI的效率。并且氟达拉滨对AAV-HR KI效率的提高，不仅仅是针对无核酸酶的情况，同样能在加入CRISPR/Cas9系统后增强KI效率[3]。该研究成果2022年4月在线发表于Nature biotechnology杂志[3]。
首先，研究者设计了一个方便定量的报告基因系统，使用靶向GAPDH基因的无启动子载体rAAVDJ-GAPDH-P2A-GFP来进行AAV-HR技术KI效率的评价（图一a）。成功KI的细胞在GAPDH启动子的作用下会持续性表达绿色荧光蛋白 (GFP)。研究者筛选了多个已报道可提高AAV转导效率的小分子化合物，发现仅有羟基脲（HU）可以提高GFP阳性细胞的比例（图一b）。HU是一种核糖核苷酸还原酶 (RNR) 抑制剂，研究者进而筛选了一系列RNR抑制剂。经小分子化合物预处理16小时的Huh7细胞，随后感染报告基因AAV，14天后FACS检测GFP阳性细胞的比例。结果显示，除HU之外，经氟达拉滨（fludarabine，Flu）和triapine（Tri）预处理后，GFP阳性细胞显著增加；而硝酸镓（Gal）没有增强效果（图一b）。另外，研究者还测试了携带启动子自身可表达荧光素酶的AAV，发现HU、Flu和Tri也能增加AAV的转导效率（图一c）。为了进一步明确是RNR被抑制后的作用，研究者敲降了RNR复合物的主要亚基RRM1[4]（图一d）。结果发现，RRM1敲降后确实可提高GFP阳性细胞的比例（图一e）。经PCR验证，基因组正确KI的基因型确实仅在AAV感染后出现，HU和Flu的预处理增多了阳性条带的丰度（图一f）。研究者在小鼠肝癌细胞系Hepa1-6中另外测试了其他位点的KI，将AAV更换为rAAVDJ-Alb-P2A-GFP（图一h）。同样地，HU和Flu的预处理可显著增加成功KI的GFP阳性细胞比例（图一g）和融合mRNA的表达（图一i）。以上结果表明，RNR抑制剂HU和Flu可在体外细胞水平上增加AAV的转导效率以及AAV-HR技术的KI效率。
图一 RNR抑制剂增强了人源和鼠源细胞系中AAV-HR的KI效率[3]
接下来，研究者进行在体AAV-HR的KI效率测试，采用的是之前测试过的rAAV8-Alb-P2A-hF9[2]。在3-4周龄的小鼠中前三天每天一次腹腔注射PBS、HU或Flu，并在第一天给药后进行尾静脉注射AAV（图二a）。结果显示，与对照小鼠相比，只有Flu处理的小鼠血浆中hF9含量持续增加（图二b），且这种增加不是通过提高AAV体内病毒载量导致的（图二c）。经qPCR检测显示Flu处理后的小鼠，成功KI的融合mRNA表达显著升高约5.1倍（图二d和e）；另外，包含了成功KI、随机整合和游离型复制的hF9总mRNA显著升高约4.4倍（图二d和f）；两者的比值不受Flu处理的影响（图二g）。研究者又测试了7天龄的新生鼠，同样地，Flu处理2天可显著增加小鼠血浆中hF9含量（图二h），且对新生鼠无明显毒副作用。研究者在3-4周龄的小鼠中更换给药时间，分别在第1、3、5天进行3次给药，发现Flu隔天给药3次的方式更加显著地提高了血浆中hF9含量（图二i）。这些数据表明，Flu通过提高AAV-HR的KI效率来显著增加小鼠体内hF9的表达。
图二 氟达拉滨处理可显著提高小鼠体内肝细胞中AAV-HR的KI效率[3]
Flu对细胞有多种作用，可在DNA复制或修复过程中插入DNA，并通过抑制RNR减少dNTP导致转录提前终止[5]。这些事件都会触发DNA修复通路，可能是Flu提高HR效率的原因。因此，研究者进一步通过小鼠肝脏切片的γH2AX染色来测定DNA损伤反应。结果显示，BrdU处理仅能检测到很低的γH2AX信号，而Flu处理显著增多了γH2AX阳性信号，并在BrdU去除Flu后显著减少（图三a-c）。肝脏组织WB结果也显示了一致的结果，其中药物DEN是造成DNA损伤的阳性对照（图三d）。以上结果表明Flu是通过短暂激活DNA修复信号来提高AAV-HR的KI效率。
图三 氟达拉滨在小鼠中诱导短暂的DNA损伤反应[3]
现今KI多是依靠CRISPR/Cas9系统来实现，其精准识别与切割造成DNA损伤，进而介导细胞HR来实现正确KI。因此最后，研究者验证了Flu是否也能作用于CRISPR/Cas9介导的HR。研究者采用携带saCas9和靶向Alb sgRNA的AAV，以及rAAVDJ-Alb-P2A-GFP，并调整两种AAV的比例进行测试（图四a）。结果显示，Flu处理后可增加所有实验组的GFP阳性细胞数量（图四b和c）和融合mRNA的表达量（图四d）。但是与此同时，Flu处理也增加了2-3倍的错误修复造成的插入或缺失突变（图四e）。针对前12个突变基因进行测序分析，Flu处理没有造成错误大片段的插入（图四f）。总的来说，Flu可以通过激活DNA损伤修复来增强CRISPR/Cas9介导的在体基因编辑效率。
图四 氟达拉滨可提高CRISPR/Cas9在体基因编辑效率[3]
综上所述，短暂的氟达拉滨处理可激活DNA损伤修复来显著提高AAV-HR技术和CRISPR/Cas9介导的正确KI效率，并且无明显毒副作用。在临床应用方面，未来可利用已上市获批的氟达拉滨药物进行短暂处理，以期提高AAV-HR技术介导基因治疗元件安全插入基因组的效率，使其长期发挥作用，实现终身治疗性基因补偿。
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参考文献
1. Gao GP, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM: Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2002, 99(18):11854-11859.
2. Barzel A, Paulk NK, Shi Y Huang Y, Chu K, Zhang F, Valdmanis PN, Spector LP, Porteus MH, Gaensler KM et al: Promoterless gene targeting without nucleases ameliorates haemophilia B in mice. Nature 2015, 517(7534):360-364.
3. Tsuji S, Stephens CJ, Bortolussi G, Zhang F, Baj G, Jang H, de Alencastro G, Muro AF, Pekrun K, Kay MA: Fludarabine increases nuclease-free AAV- and CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination in mice. Nat Biotechnol 2022.
4. Aye Y, Li M, Long MJ, Weiss RS: Ribonucleotide reductase and cancer: biological mechanisms and targeted therapies. Oncogene 2015, 34(16):2011-2021.
5. Huang P, Sandoval A, Van Den Neste E, Keating MJ, Plunkett W: Inhibition of RNA transcription: a biochemical mechanism of action against chronic lymphocytic leukemia cells by fludarabine. Leukemia 2000, 14(8):1405-1413.
