技术分享：精准靶向肺部的新型脂质纳米颗粒
Tips：在“心房特异性的AAV9递送系统”技术分享中，我们介绍了病毒递送系统AAV9的载体设计，从而实现心房特异性的基因递送。本期将详细介绍非病毒递送系统LNPs的改造，从而实现肺部特异性的mRNA递送。
开发mRNA药物来治疗疾病具有巨大潜力，例如开发mRNA疫苗[1]、蛋白质替代疗法[2]和肿瘤免疫疗法[3]以及基因治疗[4]等。将mRNA安全有效地递送至体内特定器官和细胞是开发mRNA药物的主要挑战。脂质纳米颗粒（LNPs）作为一种非病毒的药物递送工具，大多局限于将mRNA药物递送至肝脏[5]。为了充分发挥mRNA药物的治疗潜力，将mRNA高效递送至肝外特定组织的技术亟待开发。
2022年2月，PNAS上发表了美国塔夫茨大学许巧兵教授团队研发的新型N-系列LNPs，可特异性靶向肺部组织递送mRNA。并利用其中的306-N16B LNP靶向递送Tsc2 mRNA至肺部组织，可有效缓解肺淋巴管肌瘤病（LAM）模型小鼠的肿瘤负荷[6]。
由于LNPs进入血液后，其表面会迅速吸附一层或多层蛋白质如血清蛋白等，形成“蛋白冠”结构。蛋白冠的存在将重塑LNPs的表面性质，从而影响LNPs与器官和细胞间的相互作用[7]。研究者前期已建立尾部含有酯键的O-系列LNPs，可选择性靶向肝脏递送mRNA[8]。本文研究者通过Michael加成反应将不同的丙烯酰胺尾部（N16B、N14B和N12B）与氨基头部（113、304和306）分别结合，生成9种可生物还原的N-系列LNPs（图一A）。将萤光素酶mRNA（fLuc mRNA）包装入N-系列LNPs，通过小鼠尾静脉注射给药。在IVIS成像系统下可观察到萤光素酶主要表达在小鼠肺部（图一B），且注射6小时后306-N16B LNP组的荧光酶表达最强，表明其肺部递送效果最佳（图一C）。
图一 N-系列LNPs的合成与体内筛选[6]
然后，研究者进一步研究N-系列LNPs靶向的肺细胞类群。选择递送效率最高的两种LNPs 306-N16B和113-N16B来递送Cre mRNA至Ai14报告小鼠体内，递送至细胞内的Cre重组酶表达将激活tdTomato红色荧光的表达（图二A）。LNPs递送7天后进行小鼠组织取样，共聚焦成像结果显示注射306-N16B和113-N16B LNPs的小鼠肺部均特异性检测到tdTomato红色信号（图二B和C）。研究者将肺部组织消化成单细胞悬液并进行流式细胞仪分析，结果表明306-N16B LNP能够选择性地将Cre mRNA递送至肺内皮细胞（图二B），而113-N16B LNP优先将Cre mRNA递送至内皮细胞，然后依次为巨噬细胞和上皮细胞（图二C）。这些结果表明，只需调整N-系列LNPs的头部结构即可靶向不同的肺细胞类群。
图二 不同头部结构的N-系列LNPs可靶向不同肺细胞类群[6]
接下来，研究者测试306-N16B LNP可装载的mRNA长度和RNA类型。相较于前述的fLuc mRNA的1,960个核苷酸与Cre mRNA的1,350个核苷酸，研究者利用306-N16B LNP同时装载4,521个核苷酸的Cas9 mRNA与靶向loxP的sgRNA（sgloxP），递送到Ai14小鼠体内（图三A）。7天后检测可见红色荧光蛋白主要分布在肺部（图三B和C）。值得注意的是，在肝脏中也能检测到少量红色荧光蛋白（图三B和C），推测可能是由于sgRNA的同时装载影响了LNP的物理属性，从而影响其组织特异靶向性。
图三 Cas9 mRNA和sgRNA的共同递送[6]
最后，研究者在肺淋巴管肌瘤病（LAM）模型小鼠上进行mRNA药物的临床前实验，评价靶向肺部的LNPs递送mRNA药物的疗效。LAM是一种由Tsc1或Tsc2基因突变失活，造成mTORC1过度激活而导致的罕见遗传性肺病。研究者将特异性靶向肺部的306-N16B LNP和特异性靶向肝脏的306-O12B LNP（O-系列LNPs）[8]，经等摩尔混合配制成LNP混合物（hLNP），利用hLNP递送Tsc2 mRNA（5,445个核苷酸）至LAM模型小鼠。其中，LAM模型小鼠是尾静脉注射Tsc2-null TTJ肾上皮肿瘤细胞模拟肺部结节的荷瘤小鼠，造模24天后开始隔天给药进行5次治疗（图四A）。造模34天作为实验终点，发现与hLNP空载组和未治疗组相比，装载Tsc2 mRNA的hLNP治疗可显著抑制肺结节的生长（图四B），IHC结果表明hLNP递送Tsc2 mRNA可显著降低肿瘤内的细胞增殖，并增强T细胞的浸润（图四C和D）。以上结果表明，特异性肺部靶向的LNPs可递送mRNA药物来治疗LAM。
图四 靶向肺部的LNPs递送mRNA药物治疗LAM的疗效评价[6]
综上所述，研究者开发的新型N-系列LNPs，可以装载不同大小的mRNA药物，精准靶向肺部组织进行定向治疗，为治疗LAM提供更多可能。通过调整LNPs的头、尾部结构以及键合方式，可以改变LNPs的组织器官靶向性。进一步筛选优化特异性靶向的LNPs，可拓宽mRNA药物的应用范围，助力开发精准细胞与基因治疗药物。
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参考文献
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