技术分享：基于CRISPRa-SAM小鼠的疾病造模方法

基因过表达常用于基因功能和疾病机制研究。CRISPRa（CRISPR-based transcriptional activation）系统为基因过表达提供了一个灵活高效的工具。它通过催化失活的Cas9（dCas9）融合转录激活子，结合到靶基因的启动子区域激活靶基因的转录，实现过表达的目的[1, 2]。在CRISPRa的系统中，SAM（Synergistic Activation Mediator）系统的激活效果稳定，适合在体研究[3]。SAM系统需要三个元件：（1）MS2发夹结构融合到sgRNA序列上，（2）MS2结合蛋白（MCP）与转录激活因子p65和HSF1相融合，（3）dCas9与转录激活因子VP64相融合。CRISPRa-SAM系统利用sgRNA特异性识别并结合到靶基因的启动子上，招募MCP和dCas9蛋白，从而在多种转录激活因子的协同作用下，高效模拟细胞内的转录激活[4]。

2021年5月，Nature Communications上发表了一种CRISPRa-SAM小鼠，可以结合体内递送系统来模拟多种疾病表型，包括高胆固醇血症和转甲状腺素淀粉样变（ATTR）的疾病模型[5]。

研究者首先构建了CRISPRa-SAM小鼠，在基因组安全位点Rosa26（R26）定点插入CRISPRa-SAM系统所需元件。在工具鼠中，将CRISPRa-SAM系统的两个固定元件dCas9-VP64和MCP-p65-HSF1通过2A肽连接，并在上游插入loxP-stop-loxP（LSL）终止盒以防止R26内源启动子驱动该元件表达（图一a，R26^LSL-SAM）。在Cre重组酶存在下，LSL终止盒被去除，启动CRISPRa-SAM系统的两个元件表达（图一a和b，R26^SAM）。然后将CRISPRa-SAM系统靶点识别的第三个元件sgRNA也通过打靶构建在R26上，命名为R26^#a[Gene]，其中sgRNA由U6启动子驱动，几个sgRNA序列被串联在一起（图一c）。另外，激活sgRNA的位置设计在转录起始位点（TSS）上游的300 bp以内（图一d）。

图一 CRISPRa-SAM小鼠的工作原理示意图[5] 

接着，研究者对CRISPRa-SAM小鼠的在体基因激活能力进行测试，设计sgRNA靶向激活Ttr基因的表达。将R26^3aTtr与R26^SAM两品系小鼠交配获得R26^SAM/3aTtr小鼠，ELISA检测到血清中TTR蛋白含量维持在高出对照组2.5倍的水平（图二a）。qPCR结果表明所有被测组织中Ttr表达均显著升高，内源性高表达的组织如肝脏表达上调了2.5倍，内源性低表达的组织如肺上调高达98,000倍（图二b）。RNA-Seq结果表明，在各个组织中仅有Ttr基因的表达被激活，Ttr基因组上相邻的其他基因表达并没有受影响（图二c）。为了进一步可视化证明这一结论，将R26^SAM/3aTtr小鼠与Ttr^LacZ小鼠进行交配，后者是将Ttr基因组编码序列替换为编码β半乳糖苷酶的lacZ基因（图二d）。检测R26^SAM/3aTtr;Ttr^LacZ/+小鼠发现，与对照组相比所有组织器官都有很强的lacZ阳性染色，包括本底低表达的组织器官如脾脏（图二e）。以上结果表明，CRISPRa-SAM小鼠可全身性高效特异激活靶基因。

图二 CRISPRa-SAM小鼠的在体基因激活能力验证[5]

利用CRISPRa-SAM小鼠的高效在体激活能力，可快速构建各种疾病模型。为了构建高胆固醇血症疾病模型，研究者选择了Pcsk9靶点进行测试（图三）。PCSK9是一个丝氨酸蛋白酶，主要在肝脏合成，它能够减少肝细胞中低密度脂蛋白受体（LDLR）的数量。PCSK9与位于细胞膜表面的LDLR结合后，内吞回胞质内，促进溶酶体对LDLR的降解。LDLR是胆固醇稳态的关键，它负责细胞对LDL的摄取和降解。因此，PCSK9的含量升高会导致LDLR数量减少，使得血浆中LDL水平增高，造成高胆固醇血症[6]。在工具小鼠R26^SAM中，利用AAV8病毒载体来递送靶向Pcsk9的激活sgRNA，与对照组相比均可检测到血浆中LDL胆固醇含量的显著升高，其中注射了AAV8^Pcsk9-gA1的小鼠水平升高最为显著（图三a和d）；同样地，总胆固醇水平也显著升高（图三b和e）；对高密度脂蛋白HDL的影响较小（图三c和f）。雄鼠相比于雌鼠的表型更为明显。以上结果表明，利用CRISPRa-SAM小鼠可快速构建高胆固醇血症疾病模型。

图三 CRISPRa-SAM小鼠的高胆固醇血症模型构建[5]

最后，研究者利用工具小鼠R26^SAM来构建转甲状腺素淀粉样变（ATTR）疾病模型。ATTR是由于错误折叠的转甲状腺素（TTR）蛋白在组织中的积聚而导致，主要发生在神经和心脏。ATTR的研究模型通常采用人源化TTR小鼠（TTR^Hu/Hu），将小鼠基因组的Ttr基因替换为人的TTR基因（图四a）。可是TTR^Hu/Hu小鼠虽然仅表达人源TTR蛋白，但与正常人血浆中（NHS）的TTR蛋白表达水平仍有显著差距（图四b），无法模拟ATTR疾病表型。于是研究者在纯合TTR^Hu/Hu;R26^SAM/SAM小鼠中，利用AAV8来递送靶向Ttr的激活sgRNA，与对照组相比可显著提高TTR蛋白的含量（图四c），其表达量显著高于正常人血浆水平。因此，该小鼠模型能更好地模拟ATTR疾病表型。

图四 CRISPRa-SAM小鼠的转甲状腺素淀粉样变模型构建[5]

综上所述，研究者将CRISPRa-SAM系统的两个固定元件定点插入在基因组安全位点，来构建工具小鼠R26^SAM，使得两个元件可以在小鼠体内全身性稳定表达；并且单拷贝的插入形式可以被稳定遗传，方便小鼠繁殖与鉴定。另外，将CRISPRa-SAM系统靶点识别的第三个元件sgRNA利用AAV等载体进行体内递送，方便快速构建质粒，更换各种靶点，增加应用灵活性；并能根据体内递送系统的属性，靶向不同组织，实现组织特异性地激活靶基因，从而加速在体研究和药物研发的进程。

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参考文献

1. Lundh M, Pluciñska K, Isidor MS, Petersen PSS, Emanuelli B: Bidirectional manipulation of gene expression in adipocytes using CRISPRa and siRNA. Mol Metab 2017, 6(10):1313-1320.

2. Matharu N, Rattanasopha S, Tamura S, Maliskova L, Wang Y, Bernard A, Hardin A, Eckalbar WL, Vaisse C, Ahituv N: CRISPR-mediated activation of a promoter or enhancer rescues obesity caused by haploinsufficiency. Science 2019, 363(6424):eaau0629.

3. Chavez A, Tuttle M, Pruitt BW, Ewen-Campen B, Chari R, Ter-Ovanesyan D, Haque SJ, Cecchi RJ, Kowal EJK, Buchthal J et al: Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature methods 2016, 13(7):563-567.

4. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H et al: Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 2015, 517(7536):583-588.

5. Hunt C, Hartford SA, White D, Pefanis E, Hanna T, Herman C, Wiley J, Brown H, Su Q, Xin Y et al: Tissue-specific activation of gene expression by the Synergistic Activation Mediator (SAM) CRISPRa system in mice. Nat Commun 2021, 12(1):2770.

6. Shapiro MD, Tavori H, Fazio S: PCSK9: From Basic Science Discoveries to Clinical Trials. Circulation research 2018, 122(10):1420-1438