技术分享：新型无DNA切割的dCas9-SSAP基因编辑系统
Tips：在“大片段DNA高效插入的基因编辑工具FiCAT”技术分享中，我们介绍了将Cas9与PB转座酶相结合开发的基因编辑工具FiCAT，可实现大片段DNA在基因组上的高效定点插入。本期将介绍dCas9与SSAP相结合开发的新型基因编辑工具dCas9-SSAP，通过无DNA切割的同源重组来介导精准基因编辑。
CRISPR-Cas9介导的精准基因编辑需要三个关键步骤：精准识别、精准切割和精准修复。在第二步精准切割中，由于CRISPR-Cas9的切割会形成DNA双链断裂（DSB），造成基因组上一定程度的不稳定，因此在临床应用中存有潜在风险。CRISPR-Cas9的基因编辑效率主要取决于第三步精准修复，是由细胞自行选择DNA损伤修复机制来完成的，主要包括同源修复（HDR）与非同源末端连接（NHEJ）修复等。细胞启用不同修复机制会产生不同编辑产物，HDR修复机制最为精准，在接头处两端不会引入任何突变，但是修复效率低[1]。
为进一步优化基因编辑系统，科学家们致力于寻找无需DNA切割就能精准修复的系统，即简化为精准识别、精准修复两步就能完成精准基因编辑，从而在提高基因编辑效率的同时，又能保证安全性。2022年2月，在Nature cell biology杂志上发表了一种新型无DNA切割的基因编辑工具dCas9-SSAP，将dCas9系统的精准识别能力与单链退火蛋白（SSAP）的同源重组能力相结合，实现DNA片段在基因组上的高效定点插入，具有广阔应用前景[2]。研究者首先将目标锁定到噬菌体同源重组系统中的多个SSAP，它们介导的同源重组不依赖于DNA断裂[3, 4]。dCas9系统具有与Cas9系统一样的精准识别能力，能高效定位到基因组的靶序列上，解开DNA双链形成R-茎环，且不对DNA进行切割[5-7]。因此，将SSAP与结合dCas9-sgRNA-MS2茎环结构的MCP蛋白相融合，即可利用dCas9系统招募SSAP到靶序列上，进而介导靶序列发生同源重组[8]（图一a和c）。研究者选取了三个管家基因DYNLT1，HSP90AA1和ACTB来进行测试，在对应基因组中的终止密码前定点插入P2A-mKate元件，利用红色荧光蛋白mKate的表达来评价基因编辑效率（图一b和c）。通过在细胞水平比较LBet、RecT、gp2.5这三种噬菌体SSAP，发现RecT系统的mKate阳性细胞比例最高，即基因编辑效率最高（图一d和e），因此选择RecT的SSAP系统用于后续研究。
图一 dcas9-SSAP系统的开发[2]
接着，研究者将dCas9-SSAP系统与Cas9系统进行平行性比较。在获得的最终编辑产物中，由于Cas9系统涉及多个DNA损伤修复方式会产生多样化的编辑产物，而dCas9-SSAP系统的编辑产物主要为精准修复产物，准确率高达90-99%（图二a）。两个系统的精准编辑效率相当，dCas9-SSAP系统效率高一些（图二a和b）；都能高效实现1.7 kb DNA的精准插入，但效率低于800 bp DNA的插入（图二b）。研究者在多个基因靶点上进行测试，dCas9-SSAP系统的最高精准编辑效率可接近20%（图二c）。值得注意的是，研究者并没有进一步研究dCas9-SSAP系统可插入的最大DNA长度。
图二 dCas9-SSAP系统与Cas9系统的精准编辑效率比较[2]
研究者进一步证明dCas9-SSAP系统是否确实不依赖于DNA断裂后的HDR修复模式，通过添加HDR修复所需的Mre11-Rad50-Nbs1（MRN）复合体的抑制剂Mirin，或者RAD51的抑制剂B02和RI-1来抑制HDR修复通路（图三a）。结果表明，三种抑制剂的添加均不影响dCas9-SSAP系统的精准编辑效率，对照组Cas9系统的效率被显著降低（图三b），表明dCas9-SSAP系统区别于Cas9系统，并不依赖于DNA损伤修复机制。研究者采用胸腺嘧啶核苷双阻断法（DTB）将细胞同步化到G1-S期（图三c），发现同Cas9系统一致，DTB处理显著降低了dCas9-SSAP系统的精准编辑效率（图三d），表明dCas9-SSAP系统为细胞周期依赖，S期更有利于dCas9解开DNA双链。
图三 dCas9-SSAP系统的机制研究[2]
最后，为了扩大dCas9-SSAP系统的应用前景，研究者筛选出截短型mSSAP系统，可将整个系统元件设计在两个载体中，利用AAV病毒系统来进行基因递送（图四c）。根据RecT蛋白的二级结构，共设计了14个不同长度的RecT截短体，并筛选出精准编辑效率与全长相近的最短截短体mRecT（45-251 AA）（图四a和b）。研究者进一步将dCas9系统换成体积更小的dSaCas9系统，使得dSaCas9-mSSAP系统可包装进两种AAV病毒。细胞水平的基因递送结果表明dSaCas9-mSSAP系统的精准编辑效率与全长dSaCas9-SSAP系统基本一致（图四d）。
图四 截短型dSaCas9-mSSAP系统[2]
综上所述，dCas9-SSAP基因编辑工具不依赖于DNA损伤修复机制，极少造成DNA损伤，保证了基因组DNA的稳定性。其编辑产物主要为精准编辑产物，不会产生其他各种错误修复的基因型，显著提高了在体基因治疗的安全性。dCas9-SSAP系统的编辑效率与Cas9系统的精准编辑效率相当，甚至可能更高，为科学研究和基因治疗等转化应用提供了一种更为安全的选择。
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参考文献
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4. Thomason LC, Costantino N, Court DL: Examining a DNA Replication Requirement for Bacteriophage lambda Red- and Rac Prophage RecET-Promoted Recombination in Escherichia coli. mBio 2016, 7(5):eD1443-16.
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7. Knight SC, Xie L, Deng W, Guglielmi B, Witkowsky LB, Bosanac L, Zhang ET, El Beheiry M, Masson JB, Dahan M et al: Dynamics of CRISPR-Cas9 genome interrogation in living cells. Science 2015, 350(6262):823-826.
8. Wang CK, Cheng JKW, Zhang QH, Hughes NW, Xia Q, Winslow MM, Cong L: Microbial single-strand annealing proteins enable CRISPR gene-editing tools with improved knock-in efficiencies and reduced off-target effects. Nucleic Acids Res 2021, 49(6):e36.