技术分享：谱系示踪CD4+常规T细胞的小鼠模型构建

Tips：在“一个集合Vika、Flp、Dre和Cre重组系统的报告基因小鼠模型”的技术分享中，我们介绍了四种位点特异性重组酶（SSR）系统，本期将分享利用SSR系统的组合来进行特定免疫细胞的谱系示踪。

细胞谱系示踪是指利用各种方式来标记特定细胞群体，从而追踪观察该细胞群体及其后代所有细胞的生命活动。位点特异性重组酶（SSR）系统的开发，极大拓宽了细胞谱系示踪的应用范围及其研究。早期T细胞在胸腺的发育过程是由CD4和CD8双阴性（CD4^-CD8^-）细胞，分化成CD4和CD8双阳性（CD4⁺CD8⁺）细胞，最终分化为成熟的CD4或CD8单阳性（CD4⁺或CD8⁺）T细胞，从而进入外周血定居于外周免疫器官中[1]。在成熟的CD4⁺ T细胞中，包含常规T细胞（Tconv）和调节性T细胞（Treg）两种细胞亚群，其中调节性T细胞（Treg）可用Foxp3来特异性示踪[2]，而Tconv由于缺乏特定标志物难以被谱系示踪。

2021年10月，Immunity杂志上报导了一种可用于CD4⁺ Tconv细胞谱系示踪的研究工具，即CD4conv^{iCreERT2-hCD2}小鼠模型，巧妙利用FlpO-Frt和Cre-loxP两种SSR系统，在标记了成熟CD4⁺ T细胞的基础上排除了Foxp3⁺ Treg细胞，从而实现特异性标记CD4⁺ Foxp3^- 的Tconv细胞群体[3]。

首先，如何来标记成熟的CD4⁺ T细胞呢？由于CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞享有共同的发育通路，所以无法简单用CD4来特异性标记CD4⁺ T细胞。在定向分化为CD4⁺ T细胞的过程中需要一个关键的转录因子ThPOK，它由Zbtb7b基因编码，能促进CD4和CD8双阳性T细胞定向分化为CD4⁺ T细胞，同时抑制分化为CD8⁺ T细胞的基因表达[4]。另外，Zbtb7b沉默子是一种顺式调节元件，通过抑制Zbtb7b基因的表达来促进双阳性T细胞定向分化成CD8⁺ T细胞[5]。利用这一特点，前期有研究者开发了一种ThPOK-Cre工具鼠，仅在表达了ThPOK的CD4⁺ T细胞中才会启动Cre重组酶和人源CD2的过表达（图一）[5]。

图一 ThPOK-Cre工具鼠的工作原理[5]

本文研究者将ThPOK-Cre工具鼠改造成ThPOK^{F/F.iCreERT2.hCD2}，将Cre替换成他莫西芬诱导的iCreERT2元件，并在iCreERT2-hCD2元件的两侧插入Frt位点（图二B）[3]。ThPOK^{F/F.iCreERT2.hCD2}小鼠在他莫西芬诱导下仅在CD4⁺ T细胞中启动Cre重组酶和人源CD2的过表达（图二C）。该小鼠为转基因小鼠，随机整合在13号染色体上。

图二 CD4conv^{iCreERT2-hCD2}小鼠的构建与验证[3]

接着研究者构建了指示Foxp3⁺ Treg细胞的Foxp3^{Ametrine-FlpO}小鼠，在Foxp3基因组上的启动子ATG后面插入Ametrine-2A-FlpO-2A元件，从而在Foxp3⁺ Treg细胞中启动Ametrine荧光蛋白和FlpO重组酶的表达（图二A和二C）。该小鼠模型是利用小鼠胚胎干细胞囊胚注射法获得的。

研究者将两个品系的小鼠交配，从而获得CD4conv^{iCreERT2-hCD2}小鼠模型（图二C）。在CD4⁺ Foxp3⁺ 的Treg细胞中，由于表达FlpO重组酶，从而在基因组上特异性切除iCreERT2-hCD2元件，因此仅有在CD4⁺ Foxp3^- 的Tconv细胞中才会携带iCreERT2-hCD2元件（图二C）。经流式分析淋巴结（LN）的CD4⁺ T细胞，hCD2⁺的CD4⁺ T细胞确实不表达Ametrine荧光蛋白（图二D）。进一步检测CD4conv^{iCreERT2-hCD2}小鼠与Rosa26^LSL.tdTomato报告基因小鼠杂交的子代，经他莫西芬给药后，可观察到tdTomato红色荧光蛋白主要在Ametrine-和hCD2⁺的CD4⁺ T细胞，即CD4⁺ Foxp3^- 的Tconv细胞中表达，表明Cre重组酶活性主要在CD4⁺ Tconv细胞中（图二E和二I，86.4%）。另外，Cre重组酶活性表现为他莫昔芬剂量依赖（图二F-H）。需要注意的是，该模型仍有小部分13.6%的tdTomato表达在其他类群的免疫细胞中。

综上所述，CD4conv^{iCreERT2-hCD2}小鼠模型将他莫昔芬诱导的Cre重组酶活性主要限制在CD4⁺ Tconv细胞类群中，从而可以用于CD4⁺ Tconv细胞类群特异的基因重组，进行相关谱系示踪等研究。

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参考文献

1. Taniuchi I: CD4 Helper and CD8 Cytotoxic T Cell Differentiation. Annu Rev Immunol 2018, 36:579-601.

2. Lio CWJQ, Hsieh CS: A two-step process for thymic regulatory T cell development. Immunity 2008, 28(1):100-111.

3. Andrews LP, Vignali KM, Szymczak-Workman AL, Burton AR, Brunazzi EA, Ngiow SF, Harusato A, Sharpe AH, Wherry EJ, Taniuchi I et al: A Cre-driven allele-conditioning line to interrogate CD4(+) conventional T cells. Immunity 2021, 54(10):2209-2217.

4. Wang L, Wildt KF, Castro E, Xiong Y, Feigenbaum L, Tessarollo L, Bosselut R: The Zinc Finger Transcription Factor Zbtb7b Represses CD8-Lineage Gene Expression in Peripheral CD4(+) T Cells. Immunity 2008, 29(6):876-887.

5. Mucida D, Husain MM, Muroi S, van Wijk F, Shinnakasu R, Naoe Y, Reis BS, Huang YJ, Lambolez F, Docherty M et al: Transcriptional reprogramming of mature CD4(+) helper T cells generates distinct MHC class II-restricted cytotoxic T lymphocytes. Nat Immunol 2013, 14(3):281-289.