技术分享：全新蛋白质定向递送系统PVC
内共生细菌是一类寄生在宿主体内的特殊细菌，它们已进化出复杂的传递系统来递送可调节宿主的生物因子[1]。例如，细胞外可收缩注射系统（extracellular contractile injection system，eCIS)，这是一类类似于噬菌体尾部的注射器状纳米机器[2]，通过驱动“针头”穿过细胞膜从而将蛋白质有效载荷注入真核细胞中。研究发现eCIS可以靶向小鼠细胞[3]，进而提高其作为蛋白质递送工具的可能性。然而，eCIS的活性尚未在人类细胞中得到证实，并且eCIS识别靶细胞的机制仍有待阐明。
2023年3月29日，Nature杂志上报道了通过工程化改造发光杆菌的细胞外可收缩注射系统（eCIS）PVC（Photorhabdus virulence cassette），研发出一种全新的蛋白质定向递送系统。研究者通过对PVC的改造，使其可以在体外成功递送不同类型的蛋白质有效载荷，并实现特异性靶向不同生物体的多种细胞类型。现已具备在活体小鼠体内特异性递送蛋白质的能力，且不诱发局部免疫反应[4]。
首先，研究者摸索PVC的表达纯化和蛋白质装载条件。PVC是发光杆菌Photorhabdus来源的eCIS，以内共生体的形式存在于昆虫致病线虫中[5]。PVC是由一个约20 kb的操纵子组成，包含16个核心基因pvc1-16（图一a，蓝色和紫色）、下游2个有效载荷基因Pdp1和Pnf（红色）以及4个推测的调控基因（橙色）。与所有的eCIS一样，Pdp1和Pnf是通过PVC鞘的收缩以及随后刺突管复合体的分解进入靶细胞（图一b）。研究者将PVC系统分成结构pPVC和有效载荷pPayload两个质粒，在大肠杆菌中表达PVC系统[6]。使用透射电子显微镜（TEM）观察，发现纯化后的PVC蛋白质复合物类似于经典的eCIS结构，包含完整的基板和鞘结构，长度约为116 nm（图一c）。将纯化的PVC复合物与Sf9昆虫细胞孵育后，可观察到PVC稳定结合在Sf9细胞表面（图一d），表明大肠杆菌内的PVC表达与纯化成功。为了将PVC开发成蛋白质递送工具，研究者接着研究PVC的装载方式，发现在有效载荷蛋白Pdp1和Pnf的N末端都有一段高度无序区域，该区域对于有效载荷是必需的，被称为包装结构域（packaging domain，PD）。将Pdp1的PD序列与其他蛋白GFP、Cre或者ZFN进行融合，发现在有效载荷装载器pvc15存在的情况下，三种新的蛋白都能被包装进PVC内（图一e），即成功建立了一种将目的蛋白质装载入PVC颗粒的通用方法。研究者将含有毒素有效载荷的天然PVC与Sf9细胞孵育，观察到其强大的细胞毒性，并且此过程需要推测的靶标识别基因（pvc13，编码尾纤维）和pvc15的存在（图一f）。此外，将Cre装载入PVC后，与表达有loxP-GFP的Sf9细胞孵育，也可观察到由Cre介导的GFP阳性信号（图一g）。以上结果表明，利用工程化改造的PVC可装载入目的蛋白质，并将其递送至靶细胞内发挥其生理功能。
图一 重编程的PVC可实现真核细胞的蛋白质递送[4]
其次，研究者尝试改变PVC的细胞靶向性。虽然PVC与靶细胞结合的机制尚不清楚，但可收缩尾噬菌体的靶标识别方式已被了解[7]，研究者提出使用类似的技术可能改变PVC的靶向特异性。根据预测结构域，推测PVC的尾纤维基因pvc13可能参与靶标识别。于是，研究者使用AlphaFold[8]来预测Pvc13的3D结构，推测其远端区域可能与靶细胞初始接触（图二a），预测在其C端形成一个具有球状尖端的螺旋管结构，可能是整个尾纤维的结合结构域。随即，研究者将推测的Pvc13靶标识别结构域（氨基酸403-476）删除，替换成可特异性结合人类细胞的结构域，分别构建了Pvc13-Ad5-knob和Pvc13-E01-DARPin（EGFR特异性设计的锚蛋白重复结合域（DARPin）E01）。以过表达EGFR且对Ad5感染敏感的A549人肺腺癌细胞作为模型细胞系，发现仅有携带Pvc13-Ad5-knob或Pvc13-E01-DARPin的天然毒素PVC可以有效地杀死A549细胞；且将装载蛋白替换为Pdp1-NTD–Cre后，可在A549 loxP-GFP细胞中观测到GFP表达（图二a）。值得注意的是，当PVC携带突变的Ad5（Δ491/492）或非靶向DARPin（抗溶菌酶DARPin A4）时，则表现出无细胞内活性（图二a）。利用Pvc13-Ad5-knob系统递送Cas9时，在RNA的引导下，PVC可靶向HEK 293FT细胞，实现递送的Cas9成功产生靶基因序列的插入和缺失（图二b）。此外，研究者还递送了锌指脱氨酶（ZFD），它由锌指结构域与分裂脱氨酶相连的系统组成[9]，可以观察到靶向人类TRAC位点的目标碱基G-A替换（图二c）。受PVC递送毒素靶向杀伤的内源性生物功能的启发，研究者采用Pvc13-CD4-DARPin系统递送Pdp1和Pnf，此时PVC可特异性靶向CD4高表达的白血病T细胞Jurkat细胞产生细胞毒性（图二d）。以上数据表明，可通过改造PVC，使其递送特定的蛋白质，并特异性靶向不同人类细胞实现多种功能。
图二 重编程的PVC可特异性靶向人类细胞[4]
再次，研究者测试了PVC的细胞靶向特异性。构建了一组表达不同标签抗体的HEK 293FT衍生细胞，相应地将标签序列插入尾纤维Pvc13的远端结合域，并利用PVC系统递送Cre。仅有当PVC特异性结合到相应的靶细胞后，才能将Cre递送入含有loxP-GFP的细胞，激活GFP的表达（图三a和b)，表明PVC的细胞靶向高特异性。此外，研究者评估了PVC对EGFR的靶向特异性，采用Pvc13-E01-DARPin系统递送Pdp1和Pnf时，发现PVC可以特异性杀死EGFR+细胞系（A549和A431），而不能杀死EGFR−细胞系（Jurkat和3T3）（图三c）。进一步将EGFR转染到EGFR−细胞系3T3后，发现PVC可以杀死3T3 EGFR+细胞（图三d）。以上数据表明，PVC介导的蛋白质递送系统具有高度特异性，这种依赖于受体识别的细胞靶向性将极大拓宽其应用范围。
图三 PVC介导的蛋白质递送具有高度特异性[4]
最后，研究者测试了PVC的蛋白质在体递送能力。使用alphafold引导Pvc13的工程化改造，筛选出两个可用于小鼠的靶向结合域。其一是经修饰的Ad5 knob结构域Ad5-knob（RGD/PK7），可将Ad5的宿主范围扩大到小鼠组织；其二是针对小鼠MHC II类分子的纳米抗体[10]（图四a）。经Pvc13改造后所产生的PVC可在小鼠细胞系以及原代细胞中显示出显著增强的活性（图四b）。于是，研究者采用Pvc13-Ad5-knob（RGD/PK7）系统递送Cre，并将PVC颅内注射到loxP-tdTomato报告小鼠中，可在海马中观察到Cre介导的tdTomato表达（图四c）。此外，从注射后的大脑中提取单细胞悬液，用流式细胞术定量神经元和小胶质细胞中的tdTomato信号，发现仅在神经元中显著富集（图四d)，表明该PVC可以在体特异性靶向神经元。并且PVC注射后没有产生任何明显的免疫细胞激活（图四e）、炎症细胞因子产生、体重减轻或细胞毒性，表明PVC治疗在这个实验过程中没有产生免疫原性或毒性。注射7天后，在大脑中就无法分离出完整的PVC（图四f），表明PVC仅在体内短暂存在，因而非常适合于暂时或短期的治疗。以上数据表明，PVC可在体递送目的蛋白质，最终可能作为人类疾病治疗的递送工具。
图四 重编程的PVC可在小鼠体内实现靶向递送[4]
综上所述，工程化改造后的PVC可作为新型蛋白质递送工具，既可以装载非天然的目的蛋白质，还可以靶向不同生物体及其细胞。PVC系统具有高度的靶向特异性，其活性取决于尾纤维与靶细胞上受体的成功结合，这种简便性的改造方法将极大地拓宽其应用范围。PVC现已实现将不同目的蛋白质精准地递送至昆虫细胞、人类细胞、原代细胞和小鼠体内，为后续基因治疗和癌症治疗提供了强有力的安全性工具和技术保障。其简易的生产工艺和灵活的多功能改造潜力，有望改变现有疗法的技术格局。
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