技术分享：发现新的铁死亡抑制因子ME1可改善肝脏缺血再灌注损伤

肝脏缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤是一种主要的肝脏损伤类型，经常发生在肝切除、肝移植等一系列临床手术中[1]，是导致移植肝早期衰竭、组织损伤、器官排斥甚至肝功能衰竭的重要原因[2]。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、坏死、自噬的新型细胞程序性死亡方式，被报道与越来越多人类疾病的发病机制有关[3]。铁死亡主要是由脂质过氧化物的过度积累引起的，谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶4（GSH/ GPX4）信号轴是其经典信号通路。当细胞内谷胱甘肽（GSH）耗竭，引发谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性下降，导致脂质过氧化物积累，达到一定程度即可诱发细胞死亡[3]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）是调节该反应的必要辅助因子[4]，其丰度降低可作为检测肝脏铁死亡的生物标志物[5]。铁死亡已被报道与肝脏I/R损伤存在着密切的相关性[6]，阻断铁死亡可显著减轻肝脏I/R造成的组织损伤[7, 8]，但I/R诱导铁死亡的作用机制仍不清楚。

2023年2月，Advanced Science期刊报道了NADPH稳态在I/R诱导铁死亡中的作用，发现产生NADPH的代谢酶苹果酸酶1（ME1）是一种新的肝脏铁死亡抑制因子。在小鼠肝细胞中特异性敲除Me1，会导致I/R后的铁死亡易感性增强以及肝损伤加重。相反地，补充ME1的底物L-苹果酸，则可以增加NADPH的丰度，保护肝脏免受铁死亡和组织损伤[9]。

首先，研究者在小鼠肝脏I/R损伤模型中[7]，检测铁死亡的重要生化特征。Slc7a11可将胱氨酸转运入细胞，用于合成GSH。GSH是Gpx4介导的脂质过氧化防御系统的必要辅助因子[3]，Gpx4将GSH转化成氧化型谷胱甘肽（GSSG），并将细胞毒性脂质过氧化物（L-OOH）还原为相应的醇（L-OH）。Gpx4是铁死亡的核心调控蛋白，抑制Gpx4活性可导致脂质过氧化物的积累，进而引起铁死亡（图一E）。在I/R处理的小鼠肝脏中，检测到GSH的耗竭，GSSG的积累，导致GSH/GSSG的比值显著下调，以及半胱氨酸的耗竭（图一A-D），表现出经典的铁死亡特征。在NADPH存在的条件下，GSSG重新转化为GSH，胱氨酸转化为GSH合成所需的底物半胱氨酸（图一E）。于是，研究者进一步检测NADPH的丰度，发现I/R处理后肝脏的NADPH耗竭和NADPH/NADP+比值下降（图一F-H）。综上所述，NADPH稳态与I/R诱导的铁死亡具有相关性。

图一 小鼠肝脏I/R损伤导致GSH和NADPH耗竭[9]

于是，研究者筛选了参与维持NADPH代谢稳态的基因，发现只有产生NADPH的代谢酶Me1在肝脏I/R损伤后的表达显著下调（图二A）。ME1负责将苹果酸转化为丙酮酸，同时将NADP⁺还原为NADPH。与mRNA水平一致，肝脏I/R损伤后Me1蛋白表达明显降低（图二B），伴随着Me1的活性下降，导致苹果酸盐在肝脏中轻微积累（图二C和D）。此外，研究者也测定了NADPH氧化酶（NOXs）的表达，它们通过消耗NADPH产生活性氧（ROS）。结果显示，Nox1、Nox2、Nox4可在肝脏中检测到表达，但在sham对照组和I/R实验组之间未观察到表达差异（图二E），提示NOXs与NADPH的耗竭无关。

图二 小鼠肝脏I/R损伤中Me1的表达与活性被抑制[9]

接着，研究者构建了条件性敲除小鼠模型来评价Me1在肝脏I/R损伤中的具体作用。在血清白蛋白（Alb）启动子驱动Cre重组酶的介导下，删除Me1基因的第4号外显子，得到肝细胞特异性Me1缺失（Me1^Alb/Alb）小鼠（图三A）。实时荧光定量PCR分析显示，Me1^Alb/Alb小鼠肝脏的Me1表达降低了约90%（图三B），免疫印迹结果也证实了这一点（图三C）。但Me1^Alb/Alb小鼠肝脏并没有出现病理变化，表明肝细胞特异性敲除Me1并不足以在体内诱导肝损伤。于是，研究者利用该小鼠模型与对照组小鼠进行肝脏I/R损伤实验，发现Me1^Alb/Alb小鼠在I/R处理后血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）表达显著增加，表明出现严重的肝损伤（图三D-F）；对肝脏I/R损伤的易感性增加（图三G）；出现肝细胞线粒体肿胀和嵴密度降低（图三H）；NADPH/NADP⁺、GSH/GSSG和半胱氨酸显著降低（图三I-K）。虽然没有观察到肝脏铁含量的变化（图三L），但发现Me1^Alb/Alb实验组小鼠肝脏的脂质过氧化反应最终产物丙二醛（MDA）和铁死亡在体生物标志物Ptgs2表达增多（图三M和N）；氧化的花生四烯酸（AA）代谢物水平显著升高，特别是12-HETE和15-HETE（图三O和P）。以上数据表明，肝细胞特异性敲除Me1可显著性促进I/R诱导的铁死亡和肝损伤，提示ME1在肝脏I/R损伤中具有抑制铁死亡的作用。

图三 Me1的肝脏缺失可促进I/R诱导的铁死亡和肝损伤[9]

随后，研究者测试了ME1的底物苹果酸能否保护I/R诱导的铁死亡和肝损伤。与预期的结果一致，补充L-苹果酸后，I/R处理小鼠的肝脏NADPH、GSH和半胱氨酸水平显著恢复（图四A-C），I/R诱导的铁死亡和肝损伤也被显著抑制（图四D-I）。但是补充L-苹果酸并不能改善I/R诱导Me1^Alb/Alb小鼠的肝损伤，表明ME1的激活是主要作用靶点。以上数据表明，补充ME1的底物L-苹果酸对于治疗肝脏I/R损伤有着巨大的临床应用潜力。

图四 补充L-苹果酸可以防止I/R损伤期间的铁死亡[9]

在之前的研究中，强调了磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）信号通路在肝脏I/R损伤中的重要性[10]。为此，研究者在公共数据库中比较了野生型和肝细胞特异性Pten缺失（Pten^Alb/Alb）小鼠的肝脏Me1 mRNA的表达水平，发现在大多数年龄组中，Pten缺失后Me1的肝脏表达显著增加（图五A）。PTEN可通过抑制Pl3K/AKT/mTOR通路，抑制细胞的增殖。经蛋白检测，I/R处理后小鼠肝脏的磷酸化Akt和磷酸化mTOR的表达降低（图五B）。为了进一步证实PTEN信号通路在I/R诱导铁死亡中的作用，野生型小鼠在接受肝脏I/R手术前分别用PTEN抑制剂（bpV）或mTOR激活剂（3BDO）进行预处理（图五C）。结果显示，bpV和3BDO的处理均能显著性增加I/R处理后肝脏Me1的表达（图五D），随后恢复了肝脏中NADPH、GSH和半胱氨酸的水平（图五E-G），并且改善了小鼠肝脏I/R诱导的铁死亡（图五H和I）和组织损伤（图五J-M）。

图五 Pten/Akt/mTOR信号通路可调节肝脏Me1的表达[9]

甾醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）是脂肪生成的主要调节因子，也是Akt/mTOR信号通路的下游靶点。S6激酶1（S6K1）是mTOR的下游效应因子，也是肝细胞SREBP1前体的候选特异性蛋白水解激酶[11]。有趣的是，SREBP1转基因小鼠的肝脏Me1表达显著升高[12]。经蛋白检测，I/R处理后小鼠肝脏的Srebp1表达和磷酸化S6k1均显著降低，在添加PTEN抑制剂和mTOR激活剂后抑制解除（图六A）。染色质免疫共沉淀（ChIP)-qPCR分析发现，在HEK293细胞中，SREBP1可以直接与ME1启动子结合（图六B）。体外过表达SREBP1可强烈激活ME1启动子驱动的荧光素酶（图六C），进一步支持了mTOR信号下游的SREBP1可直接调控ME1的转录。随后，研究者将AAV8-Srebp1注射到野生型小鼠中，实现小鼠肝脏的Srebp1过表达（图六D）。同样地，Srebp1过表达可恢复I/R后肝脏中NADPH、GSH和半胱氨酸的水平，改善小鼠肝脏I/R诱导的铁死亡和组织损伤（图六E-M），但对Me1缺失小鼠没有保护作用（图六N-Q），进一步证实了SREBP1以ME1依赖的方式抑制铁死亡。

图六 肝脏中SREBP1对于mTOR激活Me1转录、维持NADPH稳态和抑制铁死亡至关重要[9]

综上所述，I/R诱导的铁死亡与ME1的表达和活性降低显著相关。肝细胞特异性敲除Me1的小鼠表现出严重的I/R诱导铁死亡和肝损伤；而补充ME1底物L-苹果酸可恢复NADPH和GSH水平，最终抑制I/R诱导的铁死亡和肝损伤。机制上，PTEN/mTOR/SREBP1信号通路在I/R诱导铁死亡的过程中可调控肝脏ME1的表达，并且PTEN抑制剂、mTOR激活剂或SREBP1过表达均能增加肝脏NADPH，抑制铁死亡，保护肝脏免受I/R损伤。因此，进一步筛选特异性ME1激活剂来作为铁死亡抑制剂，可为肝脏I/R损伤以及铁死亡相关疾病的临床治疗提供新的思路。

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