技术分享：MESP1-RING1A复合物在心脏分化中的重要作用
先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）是新生儿最常见的出生缺陷，也是婴幼儿死亡的主要病因，发病率约为1％。心脏发育过程由转录因子（transcription factor，TF）和表观遗传调节因子组成的复杂网络调控。在不同类型的CHD患者中发现了发育关键TF MESP1的突变。MESP1是一种碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）TF，在小鼠中胚层瞬时表达[1]，不仅控制着产生第一和第二心区的最早心脏中胚层群体的细胞命运，还促使中胚层形成造血或骨骼肌肌源性祖细胞[2]。除转录因子外，染色质调节因子如多梳抑制复合体1（PRC1）、p300和黏连蛋白（cohesin）复合物也参与发育和干细胞命运决定的过程[3]，它们在CHD患者中也存在致病的基因突变。PRC1包含有E3连接酶RING1A/RING1和RING1B/RNF2/RING2，可催化H2AK119位点的单泛素化修饰 (H2AK119ub1) [4]。然而，MESP1、PRC1、p300和cohesin在心脏分化过程中的功能机制尚不清楚。
2022年11月，Developmental Cell上报道了一项MESP1调控早期心脏发育的功能和分子机制研究，发现MESP1与PRC1核心蛋白RING1A存在相互作用，协同激活早期心脏发生基因，从而驱动中胚层形成和心脏谱系特化，该过程涉及增强子-启动子相互作用和p300介导的组蛋白乙酰化。CHD患者中发现的几个MESP1致病突变都削弱了与RING1A的相互作用，扰乱了心肌细胞的正常分化，揭示该机制对于心脏发育的重要性[5]。
研究者首先筛选了一个酵母双杂交cDNA文库，发现MESP1和RING1A存在相互作用。进而在HEK293T细胞中过表达HA和FLAG标记的蛋白，通过免疫共沉淀（co-IP）实验证明FLAG-MESP1与HA-RING1A相结合，但不与RING1B相结合（图一A和B)。在人类胚胎干细胞（hESC）体外分化第四天的心脏祖细胞中过表达FLAG-MESP1，也能检测到与内源性RING1A的共沉淀（图一C)。在hESC心肌细胞分化过程中，观察到RING1A在心脏发育基因上的染色质占据增强，并且分化到第四天时RING1A基因组结合区域的62%也被FLAG-MESP1共同结合，特别是二者共同占据的启动子区占80%（图一D和E)。研究者进一步构建了6个已报道的CHD相关MESP1突变[6]（图一F)，通过体外co-IP实验，发现这些致病突变均减弱了MESP1和RING1A之间的相互作用，其中突变E11D和L147Pfs*9的削弱作用最为明显（图一G)。以上数据表明，MESP1与RING1A存在相互作用，心肌细胞分化过程中共同染色质占据在心脏发生基因上，而MESP1致病突变会损害MESP1-RING1A之间的相互作用。
图一 MESP1-RING1A在心肌细胞分化过程中共同染色质占据心脏发生基因[5]
之前Ring1A-/-小鼠仅被报道出现中轴骨骼的发育异常[7]，基于MESP1-RING1A的相互作用，研究者观测其心脏发育表型。与野生型（WT）小鼠相比，发现Ring1A-/- E8.75胚胎心管中的肌原纤维基因Tnnt2、Myh6、Myh7、Myl2和Myl7表达显著减少（图二A)；透射电镜超微结构显示Ring1A-/- E16.5胚胎的心肌细胞出现肌丝紊乱和不规则的Z盘（图二B)；心脏组织学分析还发现心脏发育迟缓、致密心肌层变薄、室间隔缺损（VSD）、主动脉骑跨、肺动脉狭窄等CHD患者表型（图二C-F)。以上数据表明，Ring1A在小鼠心脏发育过程中具有重要作用，Ring1A缺失导致小鼠心脏发育缺陷。
图二 Ring1A缺失损害小鼠正常心脏发育和心脏基因表达[5]
为了研究RING1A对人心肌细胞分化与功能的影响，研究者利用CRISPR系统获得RING1A KO hESC。正常情况下hESC分化第8天起可以观察到自发收缩的心肌细胞，而RING1A KO心肌细胞则表现出不规则且较慢的跳动速率（图三A)，以及心肌肌钙蛋白T（cTnT）表达显著降低（图三B)。分化到第35天时，免疫荧光显示RING1A KO心肌细胞尺寸变大，且50%的细胞出现紊乱的肌节结构（图三C和D)；同时肌纤维特异性结构基因和收缩调节基因的表达显著降低，但是缝隙连接基因CX43没有明显变化（图三E)；自发钙瞬变出现波形异常（图三F和G)，表明心肌收缩功能异常；虽然钙调节基因CAMK2D、CALM2和CALR的表达没有显著变化，但是钙调节基因CASQ2以及钙释放、再摄取和内流所必需的RYR2、SERCA2a和CACNA1C表达显著减少（图三H)。以上数据表明，Ring1A缺失破坏了心肌细胞肌原纤维基因、收缩调节基因和钙处理基因的表达，损害了人心肌细胞分化及其功能，这与Ring1A在小鼠心脏发育中的重要作用相一致。此外，研究者在hESC分化过程中过表达CHD相关MESP1突变蛋白，也观察到类似的心肌细胞分化异常现象。
图三 RING1A是人心肌细胞分化及其功能所必需的[5]
由于MESP1的bHLH结构域直接结合DNA，研究者推测MESP1与RING1A的相互作用可能帮助了RING1A与靶基因的结合。于是，构建了MESP1 KO hESC，分化到心脏祖细胞阶段进行RING1A的ChIP-seq分析，发现MESP1 KO后造成RING1A在原MESP1-RING1A基因组共同结合区的80%都发生了显著性减少（图四A，cluster 1和2)，这些靶基因主要富集在心血管系统发育，例如NCAM1, LEF1和MECOM基因（图四B)。进一步结合RNA-seq分析，发现RING1A结合的靶基因在RING1A KO后有1741个基因表达下调，1408个上调；而MESP1结合的靶基因在MESP1 KO后有1523个表达下调，1019个上调（图四C)；两者交集的下调基因有358个（图四D)，其中68个在早期中胚层祖细胞特化中起作用，75个与心肌病有关（图四E)；部分重要靶基因的表达变化也通过RT-qPCR得到证实（图四F)。另外，研究者在hESC分化过程中过表达CHD相关MESP1突变蛋白，也观察到类似的RING1A在共同靶基因上的结合减弱（图四G)，以及共同靶基因的激活表达受损（图四H)。以上数据表明，RING1A和MESP1的互作协同激活一群心脏分化关键基因的表达。
图四 RING1A-MESP1在心脏祖细胞阶段协同激活心脏发生基因的表达[5]
PRC1多被描述为转录抑制因子，主要通过染色质压缩来促进谱系定型，在分化过程中抑制多能性基因和其他谱系基因的表达[8]。那么PRC1复合体的核心蛋白RING1A又是如何与MESP1互作协同激活下游心脏发育基因的表达？研究者发现RING1A缺失后，其调控的下游靶基因启动子和增强子上H3K27ac水平下降（图五A和B)。Co-IP实验证明了FLAG-RING1A与组蛋白乙酰转移酶p300、cohesin组分（SMC1A、SMC3和RAD21）和CTCF的相互作用（图五C)；FLAG-MESP1也与它们有着相互作用，并且随着RING1A KO相互作用减弱（图五D)；过表达CHD相关MESP1突变蛋白后，这种相互作用也会随之减弱（图五G)。进一步地，研究者通过Hi-C和Virtual-4C检测到RING1A KO后心脏发生基因的增强子-启动子相互作用强度减弱（图五E和F)。以上数据表明， MESP1-RING1A可与p300、cohesin复合体相结合，通过影响组蛋白乙酰化、增强子-启动子染色质相互作用，协同激活下游心脏发生基因的表达。
图五 RING1A通过影响H3K27ac和增强子-启动子互作激活心脏发生基因[5]
综上所述，利用人类胚胎干细胞心脏谱系分化和小鼠遗传模型，结合表观基因组学和3D基因组学方法，研究者发现MESP1-RING1A复合物通过与p300、cohesin和CTCF相互作用，介导组蛋白乙酰化和染色质互作，激活心脏发育所必需的下游靶基因表达。并且MESP1-RING1A对于心肌细胞分化及其正常功能是必需的，MESP1致病突变会损害MESP1-RING1A之间的相互作用，影响心脏发生基因的表达以及心肌的正常分化。该研究不仅揭示了MESP1-RING1A复合物在早期心脏发育中的重要功能，而且还为深入了解MESP1、PRC1、P300和cohesin突变导致先天性心脏病的致病机制提供了一种可能性解释。
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参考文献
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