技术分享：乙醛酸盐代谢失衡增加NAFLD高草酸尿症风险
非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是西方国家最常见的肝病，常伴有肥胖、高脂血症、高血压、胰岛素抵抗等代谢综合征[1, 2]，并且会导致其他肝外并发症，如心血管疾病、慢性肾病和肾结石等。当尿液中的草酸盐浓度升高导致高草酸尿症时，会增加肾结石 的风险。肝脏中的乙醛酸盐（Glx）代谢主要生成草酸盐，占血液循环草酸盐总量的85%-90%[3]，然而其是否参与NAFLD中草酸盐等致结石物质的形成还未被详细报道。
2021年8月，Cell Reports杂志上报道了一种整合表观基因组和转录组分析的方法，发现了NAFLD小鼠肝细胞中乙醛酸盐（Glx）代谢通路的改变，主要表现为丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶（Agxt）的高甲基化和低表达，导致过多的草酸盐累积。回补Agxt或抑制羟脯氨酸（Hyp）分解代谢可改善NAFLD小鼠的草酸盐累积现象。在NAFLD患者中也发现了AGXT的下调表达，该研究为NAFLD增加肝外并发症肾结石的风险提供了一种疾病分子机制[4]。
研究者首先利用广泛使用的NAFLD小鼠模型[5]，在对照组（ob/+）和肥胖（ob/ob）小鼠的肝细胞中鉴定与脂肪变性相关的转录组和表观基因组改变，并与NAFLD患者的公共数据库信息进行交叉分析，交集得到AGXT这一候选基因（图一A）。在ob/ob肝细胞中，Agxt表现为低mRNA表达、高甲基化和低染色体可及性（图一B）。AGXT是一种肝脏特异性表达的蛋白酶，负责催化乙醛酸盐（Glx）转化为甘氨酸，防止其转化为草酸盐（图一C）。AGXT功能缺失突变会导致原发性高草酸尿症I型（PH1），并且纯合子Agxt -/-小鼠也表现出PH1疾病特征[6]。因此，研究者聚焦于研究NAFLD相关的Agxt改变对肝脏草酸盐生成的影响。
图一 乙醛酸盐代谢通路基因在NAFLD小鼠中的转录组和表观基因组改变[4]
研究者进一步分析了参与小鼠肝脏乙醛酸盐（Glx）代谢的相关基因（图一C），例如：Hao1负责在过氧化物酶体中将乙醇酸盐（Glc）转化为Glx[7]；Prodh2和Hoga1分别在线粒体中催化羟脯氨酸（Hyp）转为Glx的第一步和最后一步[8]；Grhpr在线粒体和细胞质中将Glx转为Glc；以及Ldha等肝脏特异性乳酸脱氢酶可将细胞质中的Glx转化为草酸盐。RNA-seq结果显示，Hao1与Agxt相似在ob/ob肝细胞中被显著下调，还观察到Got2的DNA低甲基化以及Hao1、Grhpr、Aldh4a1和Hoga1的染色质重排（图一C）。与对照组小鼠相比，ob/ob肝组织中的Agxt mRNA水平降低了约2倍（图一D），蛋白水平的降低也在肝脏组织的蛋白质印迹（WB）实验（图一E）和免疫组织化学（IHC）实验中得到证实（图一F）。Grhpr、Prodh2、Hoga1的mRNA表达无明显变化，而Hao1 mRNA表达略微下调，Ldha上调了2倍（图一D），表明乙醛酸盐代谢通路基因在NAFLD小鼠肝脏中的表达被改变。另外，研究者还发现了ob/ob肝细胞中Agxt启动子两个区域的甲基化显著增加（图一G）。并且在胰高血糖素的诱导下，对照组小鼠肝脏显示出约11倍的Agxt mRNA上调表达，而ob/ob小鼠仅上调2.9倍（图一H）。在体外培养实验中，ob/ob肝细胞对胰高血糖素刺激诱导的Agxt表达也不敏感（图一I），表明Agxt启动子的高甲基化降低了其对胰高血糖素的刺激应答。
接下来，研究者检测脂肪变性肝细胞体外生成草酸盐的情况，将小鼠原代肝细胞进行体外培养，并在培养基中添加乙醛酸盐（Glx）、羟脯氨酸（Hyp）和乙醇酸盐（Glc），检测草酸盐的释放情况（图二A）。实验发现，ob/ob肝细胞的甘油三酯（TAG）增加（图二B）。当添加的Hyp浓度高于3.16 mM时，ob/ob肝细胞中产生的草酸盐和Glc显著高于对照组细胞（图二C和D）。相比之下，ob/ob肝细胞对外源添加的Glc和Glx的应答与对照组相似（图二C和D）。因此，在脂肪变性肝细胞的Glx代谢途径中，只有Hyp的代谢增加了草酸盐的释放。蛋白检测结果显示，ob/ob肝细胞中的Agxt和Hao1蛋白表达基线水平均低于对照组细胞（图二E和F）。Agxt蛋白仅在对照组细胞的Hyp代谢中表达增加，而在ob/ob肝细胞中没有变化（图二E）；相比之下，Hao1蛋白在三种添加物的代谢中都有所增加（图二F）。以上结果表明，脂肪变性肝细胞Agxt的本底蛋白表达水平低，且对Hyp分解代谢的反应性降低。另外，在底物存在的情况下Hao1蛋白表达增强，二者可能协同导致产生过多的草酸盐。
图二 体外脂肪变性肝细胞的Hyp分解代谢产生更多草酸盐[4]
进而，研究者在另一种NAFLD小鼠模型上进行验证，将西方饮食（WD）和正常饮食（NCD）喂养的小鼠进行比较分析。WD喂养6周后，小鼠体重显著增加，表现为轻度脂肪变性，此时肝脏的Agxt表达显著降低，而Ldha显著增加（图三A）。WD喂养30周后，Agxt表达降低更加明显，同时伴随着Hao1和Hoga1的下调表达（图三B）。WB和IHC实验也证实了WD喂养后小鼠肝组织中Agxt蛋白水平的降低（图三C和D）。分离培养WD喂养6周的小鼠原代肝细胞，发现Agxt启动子区域的甲基化增加（图三E）；TAG水平显著上调（图三F）；对Glc、Hyp和Glx的代谢响应也与ob/ob小鼠的体外肝细胞培养结果相似（图三G和H），再次证实了NAFLD小鼠模型中Hyp分解代谢的异常。
图三 西方饮食喂养的NAFLD小鼠证实了Hyp分解代谢的异常[4]
接着，研究者进行体内验证实验，分别给ob/ob小鼠和对照组小鼠喂食NCD或含有1% Hyp的饲料10天，最后检测血浆和尿液中的草酸盐含量（图四A）。从右心室、门静脉（入肝）和肝静脉（出肝）分别进行采血检测草酸盐含量，发现ob/ob小鼠喂食Hyp后，草酸盐在肝静脉以及肝静脉/门静脉血浆中的含量显著增加，而心脏血液中的草酸盐浓度没有变化（图四B）。24小时尿草酸盐排泄量在喂食Hyp后显著增加，且ob/ob小鼠组的增加更为显著（图四C）。另外，研究者将过表达Agxt的AAV递送至小鼠体内，2周后再进行NCD或含有1% Hyp的饲料喂食 2周，最后检测血浆和尿液中的草酸盐含量（图四D）。结果显示，Agxt-AAV的递送可显著减少ob/ob小鼠血浆和尿液中的草酸盐含量（图四E），WB和IHC实验证明了AAV递送后的Agxt恢复表达（图四F和G）。以上数据表明，回补Agxt的表达可改善ob/ob小鼠喂食Hyp后的肝脏草酸盐增加。
图四 回补Agxt表达可改善喂食Hyp的ob/ob小鼠肝脏草酸盐的增加[4]
最后，研究者从患有脂肪变性或正常的17名男性中分离得到原代肝细胞，经分析发现TAG含量与AGXT mRNA表达呈负相关，且与AGXT启动子的甲基化水平成正相关（图五A）；TAG含量越高，AGXT表达则越低（图五B），反之AGXT启动子的DNA甲基化水平则越高（图五C）。供体的肝组织IHC实验显示，与中心周围标记物谷氨酰胺合成酶（GS）不同，AGXT在肝脏所有区域都有表达，且在脂肪变性肝细胞的表达较低（图五D）。研究者还分析了人类参与Glx代谢的关键基因（图五E），发现除AGXT外，GRHPR和HOGA1 mRNA在高TAG含量的肝细胞中表达显著降低（图五F），表明NAFLD患者中涉及了更为复杂的Glx代谢通路改变。研究者在肥胖儿童和青少年患者中分析NAFLD与草酸盐排泄量之间的关系，发现脂肪变性率与尿液草酸盐/肌酐呈正相关（图五G）。在体外人原代肝细胞培养实验中，在添加Glc和Glx时，草酸盐水平显著增加；而添加Hyp时，只有Glc水平显著增加，草酸盐水平无变化（图五H），表明在人原代肝细胞中，与过氧化物酶体的Glc氧化反应相比，线粒体的Hyp分解代谢对肝草酸盐的贡献似乎没那么重要。
图五 Glx代谢基因和尿草酸盐排泄的改变与NAFLD患者的肝脏脂质含量呈相关性[4]
综上所述，研究者在NAFLD小鼠模型和NAFLD患者中，发现了肝脏Glx代谢通路中AGXT的蛋白表达下调与启动子高甲基化，造成了脂肪变性的肝细胞释放出更多的草酸盐，进而可能导致肝外并发症肾结石。该研究为NAFLD增加肝外并发症肾结石的风险提供了一种疾病分子机制，也提示NAFLD患者需要注意Glx及其前体的饮食摄入，以避免高草酸尿症。
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参考文献
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