技术分享：杂交ssDNA修复模板与小分子联合使用可提高原代细胞的基因敲入效率
CRISPR/Cas系统已成为一种功能强大的基因组编辑工具。基于CRISPR/Cas系统的细胞疗法已在临床应用中通过同源定向修复（HDR）引入Cas9介导的基因敲入，纠正致病突变或者插入新的治疗基因。通常HDR模板（HDRT）可以使用不同方法进行递送，包括重组腺相关病毒（rAAV）转导和电转不同形式DNA如dsDNA、ssDNA、环形或线性DNA[1, 2]等。而HDR效率和细胞毒性随着HDRT的浓度与形式而变化。基于rAAV的方法虽然可递送大片段HDRT，细胞毒性小，基因敲入效率显著[3, 4]，但是生产成本高，工艺复杂，使其临床应用受到一定的限制[5, 6]。相比非病毒的DNA递送的生产工艺简单，开发成本低，时间短，也已应用于多种原代细胞类型。然而，大片段HDRT 的DNA递送还需要进一步降低DNA毒性、提高敲入效率和增加细胞产量，才能更好地推进其临床应用[2, 7]。
研究者先前已开发了一种方法，通过在dsDNA HDRT的两端加入Cas9靶序列（CTS），后者包括gRNA 靶序列和NGG原间隔序列临近基序（PAM），使得核糖核蛋白复合物（RNP）能够结合在HDRT的两端，促进dsDNA HDRT递送，进而增强基因敲入效率，但是细胞毒性也随之增加[2]。与dsDNA相比，ssDNA具有较低的毒性[7]，若能与CTS相结合，将有望进一步解决大片段HDRT的DNA递送问题。
2022年8月，Nature Biotechnology杂志上在线报道了一种由ssDNA及两端含有Cas9靶序列（CTS）的HDRT，称为ssCTS模板，可显著提高HDR敲入效率以及敲入细胞量，适用于多种靶位点和不同原代细胞，效率高达80–90%。同时使用可增强HDR的小分子抑制剂，可以进一步提高ssCTS模板的敲入效率约2-3倍。利用ssCTS模板和小分子的联合使用，研究者高效实现多个致病基因的基因替换，以及低成本的CAR-T细胞生产[8]。
首先，研究者筛选了多种由ssDNA以及两端包含CTS位点的小dsDNA组成的ssCTS杂交结构，其中小dsDNA可通过发夹环、退火的互补寡核苷酸或者更复杂的二级结构来形成（图一a和b）；并先设计了短的ssCTS来进行快速打靶筛选，这些不同杂交结构的113-195 nt ssCTS成功敲入后使得原代T细胞表达CD5-HA融合蛋白。经流式检测，大多数形式的ssCTS模板均可增强敲入效率（图一c），其中通过退火互补寡核苷酸在ssDNA 5′ 端和3′ 端形成CTS位点的结构（图一b，“j”）显示出最高的敲入效率（图一b和c）和较低的细胞毒性。基于此结构，研究者进而构建了较长的1500-2923 nt ssCTS模板，分别在IL2RA位点上敲入tNGFR和IL2RA-GFP，以及在TRAC位点上敲入BCMA-CAR（图一d-f）。结果显示，CTS位点的添加均可增强不同浓度dsDNA和ssDNA HDRT的基因敲入效率，但是当到达毒性剂量后敲入效率逐渐降低；与dsCTS模板（dsDNA+CTS）相比，ssCTS模板表现出更优的敲入效率和敲入细胞量，在最佳HDRT浓度下产生的敲入细胞量高达7倍（图一d-f）。
图一 ssCTS模板的设计开发实现高效基因敲入[8]
接下来，研究者利用敲入IL2RA-GFP（图一e）来评估并优化ssCTS变体。其一，测试CTS序列的特异性，发现只有与RNP识别匹配的CTS，即靶位点的CTS序列才能提高敲入效率（图二a）。其二，通过退火不同长度和覆盖率的互补寡核苷酸来确定最佳dsDNA区域，发现当dsDNA序列覆盖于gRNA序列、PAM和CTS位点下游的一小段同源臂时可以提高敲入效率，而gRNA序列上游5′ 端核苷酸则不需要被覆盖（图二b）；且在gRNA序列上游5′ 端增加核苷酸反而会降低敲入效率（图二c）。其三，通过在20 bp gRNA识别序列的5′ 端生成具有不同数量错配碱基的CTS位点，进一步测试对gRNA识别的要求。结果显示，当采用野生型和高保真型Cas9时，包含4-8个错配核苷酸gRNA增强敲入效率最为显著（图二d），可能由于这种错配保证了Cas9 RNP的结合但不切割CTS。其四，研究者测试了dsDNA序列需要覆盖下游同源臂的最佳长度，发现当大于20-40 bp的同源臂在相应的寡核苷酸中具有互补序列时具有最佳的敲入效率（图二e）。以上数据确定了最优ssCTS设计方案：在ssDNA的两端包含CTS位点，其中PAM向内靠近同源臂，gRNA序列的5' 端包括4个不匹配的核苷酸，互补寡核苷酸覆盖20 bp的gRNA靶位点、PAM序列和大约20 bp的同源臂序列（图二f）。
图二 ssCTS设计方案的评估与优化[8]
接着，研究者使用上述最优ssCTS设计方案，测试不同基因组位点、敲入模板和原代造血细胞类型的基因敲入效率。在靶向CLTA位点敲入表达CLTA-mCherry融合蛋白的实验中，发现相比dsCTS，ssCTS模板的使用显著提高了在CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、调节性T细胞（Treg）、NK细胞、B细胞、CD34+造血干细胞和γδ T细胞中的敲入效率、活细胞数和敲入细胞数（图三a-c）。在原代T细胞靶向22个基因敲入表达tNGFR的实验中，证明了决大多数ssCTS的敲入效率显著优于其他对照组（图三d）。在靶向TRAC位点敲入表达NY-ESO-1特异性TCR和其他基因的实验中，研究者构建了HDRT文库进行高通量敲入筛选实验。结果显示，与最佳dsCTS浓度相比，ssCTS的敲入效率和敲入细胞量都增加了5倍以上，同时最终敲入细胞中的HDRT文库与质粒文库保持一致（图三e-g）。以上数据表明，ssCTS模板在多种原代细胞的不同基因组位点敲入实验中，均能显著性提高基因敲入效率和敲入细胞产量。
图三 ssCTS模板在不同基因组位点和原代细胞中的应用[8]
先前有研究报道一些小分子抑制剂可以提高人原代T细胞的敲入效率，如DNA依赖蛋白激酶抑制剂NU7441和M3814，组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA，CDC7抑制剂XL413等[9, 10]。因而，研究者测试这些小分子抑制剂能否进一步增强ssCTS模板的敲入效率，分别使用M3814+TSA（MT）和M3814+TSA+XL413（MTX）组合检测了靶向22个基因敲入表达tNGFR的共计44个ssCTS模板。结果显示，MT组合普遍提高了ssCTS模板的敲入效率，而MTX组合还能进一步增强，使得15个基因的敲入效率大于50%，且6个基因达到80%以上（图三h）。以上数据表明，ssCTS和小分子抑制剂的联合使用，可显著增强HDRT敲入效率，有望广泛应用于需要高纯度或高产量敲入细胞的特定疾病靶点治疗。
最后，研究者利用ssCTS模板进行临床应用测试，采用开放阅读框（ORF）替代策略来治疗两个免疫疾病相关基因IL2RA和CTLA4[11]。在IL2RA基因1号外显子处敲入IL2RA基因ORF序列可以补偿IL2RA 11个点突变造成的缺陷（图四a）。ssCTS模板和MTX抑制剂联合使用实现了约2.3 kb全ORF IL2RA-GFP的敲入，效率高达80%（图四b）。进一步对ORF IL2RA-GFP模板进行S166N点突变，该突变消除了IL2RA蛋白表达在细胞膜表面，仅为胞内表达[12]。结果显示，S166N敲入细胞显示出细胞膜表达几乎完全缺失，以及与WT水平相当的胞内表达（图四c）；荧光显微镜观察结果显示，相比WT蛋白表达在胞内和细胞表面，S166N突变蛋白只在胞内形成了核周聚集物（图四d）。同样地，研究者检测了CTLA4基因的ORF敲入，结果显示ssCTS模板和MTX抑制剂的联合使用产生了70-80%的敲入效率（图四e和f）。进一步构建R70W、R75W、T124P致病突变体，结果显示，尽管三种突变体在细胞膜表面的蛋白表达水平有些不同，但所有三种突变都显著降低了与配体CD80的结合（图四e，g-i）。以上数据表明，ssCTS模板和MTX抑制剂的联合使用可以应用于临床基因替代治疗和疾病突变体研究。
图四 ssCTS模板和小分子联合使用实现基因治疗的高效全ORF替换[8]
此外，研究者将ssCTS模板用于大规模CAR-T细胞生产，得到的细胞数可达到临床患者所需要的剂量范围，并且具有良好的靶细胞杀伤能力。这种完全非病毒的生产工艺，能够用于生产临床规模的位点特异性T细胞工程，未来有望实现完全GMP级的低成本生产。
综上所述，研究者开发的由ssDNA及两端Cas9靶序列（CTS）组成的ssCTS模板，相比上一代dsCTS模板，具有更小的细胞毒性、更优的HDR敲入效率和敲入细胞产量的优点，适用于各种靶位点和不同原代细胞类型；同时添加可增强HDR的小分子抑制剂，还能进一步提高ssCTS模板的敲入效率。该研究证明了这种完全非病毒的ssCTS模板，在简化生产工艺、降低生产成本、保证产品质量上的优势，在基因校正、疾病变异建模和细胞疗法开发等方面具有广泛应用前景。
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