技术分享：外泌体介导Cas9 RNP复合物的有效递送，实现肝脏疾病的组织特异性基因治疗

CRISPR-Cas9系统介导的在体细胞基因组编辑，已在多种遗传疾病治疗中展示出巨大的潜力[1]，但仍存在在体递送效率低和缺乏组织特异性等问题[2]，限制了其广泛的临床应用。对于治疗性基因组编辑，Cas9核酸酶和单导向RNA（sgRNA）必须被有效地递送到细胞内并进入细胞核。其递送通常有三种选择，即编码Cas9和sgRNA的质粒DNA、Cas9 mRNA和sgRNA以及Cas9核糖核蛋白（RNP）。其中，RNP递送可避免前两种选择涉及到的DNA和mRNA在转录和翻译过程中遇到的问题，并在低免疫反应和弱脱靶活性的情况下高效完成基因组编辑[3]。然而，RNP的治疗性递送因其超过载体的承载能力而受到限制，并且容易在制剂和血流循环过程中发生降解或变性，阻碍了基于RNP的基因组编辑系统的治疗应用[4]。

外泌体是由细胞天然释放的纳米级细胞外囊泡，它们固有的生物相容性、运输能力和血流稳定性使其成为治疗性递送的潜在工具[5]。从转染了CRISPR-Cas9质粒的特定细胞中获得的内源性外泌体，已成功将Cas9 RNP递送到靶细胞[6]，但该方法比较繁琐耗时。通过电穿孔将基于DNA或mRNA的CRISPR-Cas9系统装载到纯化的外泌体中，已被安全有效地用于治疗[7]。但是，通过电穿孔将RNP等大蛋白装载到外泌体中的方式，迄今尚未有成功报道。

2022年9月，Science Advances上报道了一种称为exosome^RNP的基因组编辑递送系统，该系统通过电穿孔将Cas9 RNP装载到从肝星状细胞（HSC；LX-2）分离纯化的外泌体中。exosome^RNP具有强大的肝脏特异性在体基因组编辑活性，可用于治疗不同的肝脏疾病，包括急性肝损伤、慢性肝纤维化和肝细胞癌（HCC）[8]。

首先，研究者对exosome^RNP进行表征分析。研究者成功从LX-2细胞中分离纯化出外泌体，蛋白印迹法检测结果显示其裂解产物表达了特异性标记物CD63和TSG101，但不表达高尔基体标记物GM130（图一A和B）；动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）检测显示，外泌体大小在50-200 nm之间，呈碟状纳米囊泡结构（图一C和D）。通过电穿孔可成功将Cas9 RNP装载入纯化的外泌体中，形成exosome^RNP纳米复合物，其大小和形态没有发生明显变化（图一E-G）。

图一 exosome^RNP的特性、基因组编辑活性、生物分布以及细胞摄取机制[8]

为了检测体外递送效果，研究者利用exosome^RNP将Cas9-FITC递送至LX-2和Huh-7细胞中，结果显示仅在exosome^RNP组观察到有效的细胞质和细胞核递送（图一H和I）。研究者进一步在小鼠肝细胞中检测体外基因组编辑效果（图一J），T7E1结果显示exosome^RNP组在Bbc3（PUMA）、Ccne1和Kat5位点均实现了明显的序列插入/缺失，其效率与商品化RNP递送试剂CRISPRMAX（CMAX）相当（图一K-M）。在体内递送效果的评价中，exosome^RNP经小鼠尾静脉注射后，发现DiR标记的外泌体主要分布在小鼠的肝组织中（图一N）。进一步检测DiI标记的exosome^RNP在小鼠肝组织不同细胞类群中的生物分布，采用密度梯度法和磁珠法分离肝实质细胞、非实质库普弗细胞（KCs）、肝窦内皮细胞（LSECs）和其他非实质细胞（图一O）。结果显示，成功摄取外泌体的阳性细胞比例在不同细胞类群中有显著差别，其中KCs和LSECs显著高于肝实质细胞（图一P），且两者的相对平均荧光强度（MFI）也显著高于肝实质细胞（图一Q）。接下来，研究者具体研究exosome^RNP在细胞中的摄取机制。当细胞在4°C条件下孵育时，exosome^RNP的摄取显著减少（图一R和S），表明其细胞摄取具有能量依赖性。用不同抑制机制的一组内吞抑制剂分别处理细胞，结果显示所有组均抑制了exosome^RNP的摄取，其中肝素和细胞松弛素D的抑制作用最为显著（图一R和S），表明exosome^RNP可以通过多种途径被细胞摄取，包括网格蛋白介导的内吞作用、小窝蛋白介导的内吞、巨胞饮作用和吞噬作用。以上数据表明，研究者成功地从LX-2细胞中分离纯化出外泌体，通过电穿孔将Cas9 RNP装载入exosome^RNP中。exosome^RNP递送具有肝组织特异性，可以在体外以及体内有效地实现肝细胞内Cas9 RNP递送以及基因组编辑，提示其在治疗肝脏相关疾病方面具有潜在益处。

进而，研究者利用exosome^RNP分别测试三种肝脏疾病模型的治疗效果。其一是急性肝损伤模型。过量服用对乙酰氨基酚（APAP）会导致急性肝功能衰竭，而p53上调的凋亡调控因子PUMA在APAP诱导的肝损伤中起着关键作用[9]。因此，研究者设计了靶向PUMA的sgRNA来研究exosome^RNP介导的基因组编辑对急性肝损伤的治疗疗效（图二A）。结果显示，APAP处理后的小鼠肝脏中PUMA蛋白表达以及血清中AST和ALT水平增加，但在exosome^RNP治疗后被显著降低（图二B，E和F）。T7E1结果显示exosome^RNP递送导致靶位点序列插入/缺失率为26.1%，且仅在肝脏中观察到（图二C和D)。肝组织的HE染色结果显示，exosome^RNP治疗后的小鼠肝组织小叶中心细胞坏死和充血显著减少(图二G和J)，TUNEL阳性细胞显著减少（图二H和K），与染色质结合的核蛋白HMGB1的核定位比例显著增加（图二I和L）。此外，exosome^RNP治疗还提高了小鼠的72小时生存率（图二M）。以上数据表明，exosome^RNP介导的基因组编辑可改善APAP诱导的急性肝损伤。

图二 exosome^RNP介导的基因组编辑可改善急性肝损伤[8]

其二是慢性肝纤维化模型。细胞周期蛋白E1（Ccne1）促进HSC的增殖，并在肝纤维化中发挥重要作用[10]。因此，研究者设计了针对Ccne1的sgRNA来研究exosome^RNP介导的基因组编辑在CCL₄诱导的小鼠肝纤维化模型中的治疗效果（图三A）。结果显示，exosome^RNP治疗后，靶位点序列的插入/缺失率约为9.7%，且仅在肝组织中观察到（图三B和C）；exosome^RNP治疗显著降低了CCNE1和a-SMA的表达（图三D）。小鼠肝切片的HE染色（图三E）、肝纤维化Ishak评分（图三F）、胶原蛋白表达（图三G）和羟脯氨酸含量测定（图三H）结果显示，靶向Ccne1的exosome^RNP治疗显著改善了肝纤维化疾病指标。以上数据表明，exosome^RNP介导的基因组编辑能有效改善CCL₄诱导的肝纤维化。

图三 exosome^RNP介导的基因组编辑可改善CCL₄诱导的肝纤维化[8]

其三是肝细胞癌（HCC）模型。KAT5蛋白是HCC生长所必需的，破坏KAT5可在体外以及体内抑制HCC的增殖[11]。最后，研究者设计了靶向Kat5的sgRNA研究exosome^RNP介导的基因组编辑对原位HCC模型的治疗效果（图四A）。exosome^RNP治疗后，KAT5蛋白表达水平被显著降低（图四B）；小鼠表现为最小的肿瘤体积以及最弱的生物发光强度负荷（图四C）；小鼠生存期被显著延长（图四D）；靶位点序列的插入/缺失率约为21.3%（图四E）；肝脏切片的肿瘤细胞最少（图四F）。以上数据表明，exosome^RNP介导的靶向Kat5基因组编辑能有效改善原位HCC发展进程。

图四 exosome^RNP介导的基因组编辑用于治疗原位HCC[8]

综上所述，研究者开发了一种基于外泌体的递送系统exosome^RNP，通过电穿孔将Cas9 RNP有效地装载到来源于肝星状细胞的外泌体中，实现肝脏特异性递送和基因组编辑。exosome^RNP在急性肝损伤、慢性肝纤维化和HCC小鼠模型中均展现出强大的治疗潜力。exosome^RNP不仅克服了RNP的递送障碍，还为肝病的组织特异性精准基因治疗开辟了新的途径。此外，该技术可拓展成为有效的通用型非病毒载体，用于各种蛋白质及RNP的组织特异性细胞递送。

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参考文献

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