技术分享：用于组织特异性分离溶酶体的LysoTag小鼠
溶酶体是一种单层膜包被的细胞器，可降解各种生物大分子、清除受损的细胞器和调节细胞信号传导。溶酶体蛋白的编码基因突变会导致严重疾病，统称为溶酶体贮积症（LSD）[1]。人类遗传学研究表明，溶酶体的功能受损与年龄相关的神经退行性疾病具有相关性，包括阿尔茨海默症、帕金森病和额颞叶痴呆[2-4]。由于溶酶体通常只占细胞体积的1–3%，细胞或组织中的溶酶体内含物的含量变化很难被确定[5]。想要研究溶酶体中的蛋白质功能及其相互作用，需要先将溶酶体从细胞中分离出来。可是，传统分离纯化溶酶体的方法如基于密度梯度离心的技术，存在分离速度慢，难以较好保存溶酶体代谢组等缺点。因此，虽然大多数LSD的致病基因已经确定，但部分LSD的相关基因功能尚不清楚。
2022年9月，Nature上报道了一种可用于组织特异性分离纯化完整溶酶体的LysoTag小鼠[6]。研究者从该小鼠的肝脏和大脑中分离出完整溶酶体，并对其进行蛋白质组学和代谢组学分析，证明了小鼠大脑中溶酶体跨膜蛋白CLN3的缺失会引起甘油磷脂代谢障碍，导致甘油磷酸二酯（GPD）在溶酶体中的大量积累，揭示了CLN3缺失造成神经元蜡样脂褐质沉积症（Batten病）的相关致病机制。
研究者先前已开发了一种细胞水平快速分离纯化溶酶体的方法LysoIP，通过在溶酶体膜蛋白上安装HA蛋白标签，利用HA抗体偶联磁珠进行免疫纯化实验，即可快速分离纯化获得完整的溶酶体[5]。为了将此方法应用于小鼠组织中，研究者构建了LysoTag小鼠。将编码定位于溶酶体的TMEM192-3×HA的cDNA整合到小鼠基因组Rosa26位点的lox-stop-lox（LSL）盒下游，获得转基因小鼠。并将这些小鼠与CMV启动子驱动Cre重组酶表达的小鼠进行交配，获得组成型表达TMEM192-3×HA的LysoTag小鼠（图一a）。过表达的TMEM192-3×HA（LysoTag）可标记溶酶体，其携带的3×HA蛋白标签能够利用HA抗体进行后续免疫纯化实验。小鼠肝和脑切片的免疫荧光显示，LysoTag蛋白与溶酶体标记物LAMP1共定位（图一b)。此外研究者实验证实LysoTag蛋白过表达对小鼠组织的溶酶体蛋白质、酶活性或溶酶体超微结构没有影响，LysoTag小鼠与野生型小鼠没有明显区别，仅出现体重下降10-15%的现象。
图一 LysoTag小鼠用于组织溶酶体的蛋白质组学和代谢组学分析[6]
接下来，研究者利用HA抗体从LysoTag小鼠肝脏组织中收集免疫沉淀物（简称LysoIPs）。免疫印迹分析结果显示，与野生型小鼠肝脏组织相比，LysoIPs中大量富集溶酶体标记蛋白LAMP1和组织蛋白酶C，而不含其他细胞器如高尔基体标记物Golgin-97、线粒体标记物VDAC和内质网标记物钙网蛋白（图一c）。蛋白组学分析发现LysoIPs中高度富集溶酶体蛋白质（图一d-e）。对溶酶体的代谢物进行分析，发现LysoIPs中的胱氨酸和胆碱水平很高，而细胞质代谢物乳酸只在对照组中被检测到（图一f)。此外，对喂食和禁食的小鼠肝脏中的溶酶体代谢物分析发现，绝大多数代谢变化发生在溶酶体中，如禁食增加了小鼠肝脏溶酶体中所有核苷的表达水平(图一g和h)。以上数据表明，LysoTag小鼠可用于组织器官快速分离及获得高纯度的完整溶酶体，进一步用于溶酶体的蛋白组学和代谢组学研究。
神经元蜡样脂褐质沉积症（Batten病）是一种致命性神经退行性LSD，该疾病患者存在CLN3基因突变[7]。CLN3基因编码一种定位于溶酶体的多次跨膜蛋白，其缺失与多种细胞功能缺陷有关，包括自噬、膜融合、囊泡转运和精氨酸转运。为了确定CLN3缺失引起的溶酶体代谢组学变化，研究者将LysoTag小鼠与Cln3−/−小鼠进行杂交[8]，在子代小鼠大脑中成功分离纯化出完整的溶酶体（图二a)。由于多种LSD的发生与溶酶体中脂质分解代谢变化有关[9]，研究者使用非靶向脂质组学分析了大脑组织的溶酶体，结果显示Cln3−/−小鼠的全脑组织以及溶酶体中的双（单酰基甘油）磷酸盐（BMPs）表达水平显著下降（图二b)，而包括溶血磷脂酰甘油（LPG）在内的各种甘油磷脂的表达水平显著增加（图二c)。这些变化提示了CLN3功能与溶酶体中磷脂分解代谢相关。因此，研究者利用非靶向代谢组学来进一步寻找潜在受CLN3缺失影响的其他溶酶体代谢物。经过检测和数据分析筛选，研究者最终聚焦于189种代谢物，对其进行主成分分析(PCA)，结果显示虽然Cln3+/−和Cln3−/−小鼠的全脑样本代谢物相似，但溶酶体中的代谢物却截然不同（图二d），其中在CLN3缺失的溶酶体中有四种含量高的代谢物差异最为显著（图二e）。以上数据表明，CLN3缺失改变了溶酶体中某一组特定的而不是整个的溶酶体代谢组。研究者使用串联质谱鉴定出上述四种特异性变化的高含量代谢物都属于GPD，并最终证明GPD在CLN3缺失的溶酶体中大量积累，而CLN3是将GPD转运出溶酶体所必需的。
图二 CLN3缺失导致脑组织溶酶体中代谢物表达水平的显著变化[6]
综上所述，研究者构建的LysoTag小鼠，可在全身组织器官的溶酶体膜表面安装上HA标签，从而实现组织特异性分离纯化完整的溶酶体，用于后续蛋白质组学和代谢组学分析。利用LysoTag小鼠，研究者证明了从溶酶体中清除GPD需要CLN3蛋白。除了在溶酶体上安装了HA标签，LysoTag小鼠与野生型正常小鼠相似，可助力科学家们研究小鼠组织器官溶酶体，解析疾病相关溶酶体蛋白的功能，为开发相关疾病的诊断方法和治疗策略提供了新的研究工具。
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参考文献
1. Platt FM, d'Azzo A, Davidson BL, Neufeld EF, Tifft CJ. Lysosomal storage diseases. Nat Rev Dis Primers 2018, 4(1):27.
2. Ferguson SM. Neuronal lysosomes. Neurosci Lett 2019, 697:1-9.
3. Wallings RL, Humble SW, Ward ME, Wade-Martins R. Lysosomal Dysfunction at the Centre of Parkinson's Disease and Frontotemporal Dementia/Amyotrophic Lateral Sclerosis. Trends Neurosci 2019, 42(12):899-912.
4. Wang C, Telpoukhovskaia MA, Bahr BA, Chen X, Gan L. Endo-lysosomal dysfunction: a converging mechanism in neurodegenerative diseases. Curr Opin Neurobiol 2018, 48:52-58.
5. Abu-Remaileh M, Wyant GA, Kim C, Laqtom NN, Abbasi M, Chan SH, Freinkman E, Sabatini DM. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science 2017, 358(6364):807-813.
6. Laqtom NN, Dong W, Medoh UN, Cangelosi AL, Dharamdasani V, Chan SH, Kunchok T, Lewis CA, Heinze I, Tang R et al. CLN3 is required for the clearance of glycerophosphodiesters from lysosomes. Nature 2022, 609(7929):1005-1011.
7. Eiberg H, Gardiner RM, Mohr J. Batten disease (Spielmeyer-Sjogren disease) and haptoglobins (HP): indication of linkage and assignment to chr. 16. Clin Genet 1989, 36(4):217-218.
8. Mitchison HM, Bernard DJ, Greene ND, Cooper JD, Junaid MA, Pullarkat RK, de Vos N, Breuning MH, Owens JW, Mobley WC et al. Targeted disruption of the Cln3 gene provides a mouse model for Batten disease. The Batten Mouse Model Consortium [corrected]. Neurobiol Dis 1999, 6(5):321-334.
9. Fuller M, Futerman AH. The brain lipidome in neurodegenerative lysosomal storage disorders. Biochem Biophys Res Commun 2018, 504(3):623-628.
