技术分享：新型Cas9抑制剂的开发及其化学调控基因编辑
CRISPR-Cas系统的天然抑制剂，称为抗CRISPR（Anti-CRISPR，Acr）蛋白，已被开发为调节CRISPR-Cas基因编辑系统的有力工具[1, 2]。Acr蛋白是噬菌体和宿主细胞之间进化竞争的产物，由多种移动遗传元件（MGEs）编码以对抗原核生物中的CRISPR-Cas系统。截止目前，已经报道了88个不同的Acr家族，它们分别抑制I、II、III、V和VI型CRISPR-Cas系统[3, 4]。如AcrIIA家族蛋白对Cas9表现出多种抑制机制，分为干扰crRNA加载、阻断DNA结合和防止DNA裂解[5, 6]。其中AcrIIA2和AcrIIA4通过模拟DNA阻断Cas9与DNA的结合，AcrIIA6诱导Cas9的二聚化以降低Cas9与DNA的结合亲和力，AcrIIA14通过影响HNH结构域的活性来抑制Cas9切割DNA，AcrIIA15则直接与Cas9结合进而干扰sgRNA的加载。Acr蛋白的不同抑制机制丰富了人们对Acr在噬菌体-宿主进化竞争作用的认识，但只有少数Acr蛋白的抑制机制得到了深入的阐明。Acr蛋白作为调控基因编辑中Cas9活性的有效工具，仍有大量未知的Acr蛋白有待被挖掘，其开发应用仍然十分有限。
2022年2月，Nucleic Acids Research杂志上报道了9个新的Acr蛋白AcrIIA24-32，可以在细菌和人源细胞中通过多种机制有效抑制来源于链球菌的II-A型Cas9直系同源物SpyCas9、St1Cas9和St3Cas9。其中AcrIIA25.1和AcrIIA32.1可以阻断SpyCas9的DNA结合和切割，表现出独特的抗CRISPR特性，并进一步被研究者开发成化学诱导型抗CRISPR（iAcr）变体，可以在人源细胞中实现化学诱导调控CRISPR-Cas9介导的基因编辑[7]。
来源于链球菌基因组的不同Cas9直系同源物已被开发为各种基因编辑工具。然而，已知的Acr与大多数基因组并不匹配，表明链球菌基因组中可能存在多个未知的Acr。为了查找链球菌MGEs中潜在的Acr，研究者将AcrIIA6基因作为初始查询序列，通过BLAST程序进行生物信息学搜索，相关的相邻基因视为Acr候选基因（图一A)。随后在大肠杆菌中通过质粒干扰测定方法进行验证[8]，针对广泛使用的链球菌Cas9系统SpyCas9、St1Cas9和St3Cas9对候选基因进行测试（图一B)。在质粒干扰测定中，编码Cas9、靶向sgRNA或错配sgRNA构建在同一质粒，与含有靶位点的质粒pT以及表达Acr蛋白的质粒共转化大肠杆菌（图一B)。通过计算大肠杆菌的cfu比例来测量每个Acr蛋白的抑制活性。经过几轮“搜索验证”过程，研究者筛选了30个Acr候选基因，并鉴定出9个不同的Acr基因，命名为AcrIIA24-32（图一C）。结果显示，AcrIIA24-32蛋白表现出对SpyCas9和St3Cas9相似的抑制作用，但对St1Cas9的抑制作用截然不同，AcrIIA30和AcrIIA31均强烈抑制St1Cas9活性（图一C），表明来自AcrIIA24-32的多个Acr可以在大肠杆菌中有效地抑制链球菌的Cas9直系同源物。
图一 9个AcrIIA家族蛋白的鉴定和验证[7]
为进一步研究AcrIIA24-32是否对Cas9具有广谱抑制作用，研究者进行了噬菌斑测定，检测AcrIIA24-32对各种Cas9直系同源物的抑制活性（图二A)。实验结果显示，targeting对照组所有的Cas9直系同源物都成功减少了噬菌体斑块，其中SpyCas9靶向噬菌体的效率略低；AcrIIA24-32中AcrIIA30和AcrIIA31可以特异性抑制St1Cas9，而其他Acr可以同时抑制SpyCas9和St3Cas9；AcrIIA24-32对SaCas9、NmeCas9和FnCas9没有检测到抑制活性（图二B和C）。以上数据表明，AcrIIA24-32蛋白是链球菌CRISPR-Cas9系统的特异性抑制剂。
图二 AcrIIA24-32是链球菌CRISPR-Cas9系统的特异性抑制剂[7]
接下来，研究者验证了AcrIIA24-32是否可以在人源细胞中抑制链球菌Cas9直系同源物，将sgRNA、编码Cas9和Acr的质粒共转染HEK293T细胞，72小时后使用T7E1实验分析单个编辑效率（图三A）。结果显示，AcrIIA25.1、AcrIIA26、AcrIIA27、AcrIIA28、AcrIIA32和AcrIIA32.1几乎可以完全抑制SpyCas9的活性，抑制水平与已知的强效抑制剂AcrIIA5水平相当（图三B和C）；多个Acr可以不同程度地抑制St3Cas9活性（图三D和E）；AcrIIA30、AcrIIA31和AcrIIA31.1可以有效抑制St1Cas9的活性（图三F和G）。以上结果表明，AcrIIA24-32中的多个Acr可以在人源细胞中有效抑制链球菌Cas9直系同源物SpyCas9、St1Cas9和St3Cas9的活性。
图三 AcrIIA24-32在人源细胞中抑制不同Cas9介导的基因编辑[7]
为了研究这些新发现的Acr蛋白抑制Cas9活性的机制，研究者将编码不同荧光蛋白及Cas9蛋白的序列与靶向人类端粒DNA序列的sgRNA构建在同一质粒，利用mCherry标记的链球菌Cas9直系同源物与端粒DNA的结合来评价Acr的抗CRISPR作用，利用sfGFP标记的NmeCas9来定位端粒，选择AcrIIA24、AcrIIA25.1、AcrIIA26、AcrIIA27、AcrIIA30、AcrIIA31和AcrIIA32.1来测试U2OS细胞中Cas9直系同源物与端粒的共定位荧光成像（图四A和B）。结果显示，在表达AcrIIA5的细胞中观察到Spy_dCas9-(mCherry)3和Nme_dCas9-(sfGFP)3在端粒的共定位，而在表达AcrIIA4、AcrIIA25.1、AcrIIA26、AcrIIA27或AcrIIA32.1的细胞中，在端粒定位的红色荧光显著减弱，但不影响由Nme_dCas9-(sfGFP)3标记的绿色荧光（图四C和D）。以上结果表明，AcrIIA25.1、AcrIIA26、AcrIIA27和AcrIIA32.1可以在人源细胞中有效阻断SpyCas9与DNA的结合。同样地，研究者建立类似的荧光成像系统来评价 Acr蛋白抑制St1Cas9和St3Cas9活性的机制（图四A和B）。结果显示，AcrIIA27和AcrIIA32.1、AcrIIA30和AcrIIA31分别减弱了St3_dCas9-(mCherry)3和St1_dCas9-(mCherry)3在端粒定位的红色荧光，然而AcrIIA24没有影响St3_dCas9-(mCherry)3和Nme_dCas9(sfGFP)3在端粒的共定位（图四E-H），提示AcrIIA24可能采用其他机制来抑制Cas9。以上结果表明，在人源细胞中，来自链球菌的Acr采用包括阻断Cas9与DNA结合在内的多种机制来抑制Cas9直系同源物的活性。
图四 在人源细胞中Acr蛋白采用多种策略抑制Cas9直系同源物[7]
通过进一步的实验，研究者发现AcrIIA25.1和AcrIIA32.1可以抑制Cas9的DNA结合和DNA切割活性，显示出调节基因编辑的强大潜力，于是选择这两种Acr蛋白来进一步开发成化学诱导型Acr。研究者将配体依赖性内含肽37R3-2融合AcrIIA25.1或AcrIIA32.1蛋白使其失去活性，而4-HT与内含肽结合可触发内含肽自我剪接并恢复Acr活性以抑制Cas9（图五A）。研究者在表达蓝色荧光蛋白（BFP）的HEK293T细胞中设计先导编辑器PE介导的BFP-to-GFP报告系统，PE可以将碱基CC替换为GT从而将BFP转换为GFP使细胞表达绿色荧光蛋白（图五B）。将靶向BFP的PegRNA、编码PE和内含肽-Acr的质粒共转染HEK293T-BFP细胞（图五B），存在或不存在4-HT的情况下，通过比较BFP与GFP比例来测量内含肽-Acr对Cas9的影响。结果显示，4-HT处理对细胞中PE和WT Acr的活性没有明显影响，内含肽-AcrIIA25.1（S76）和内含肽-AcrIIA32.1（T40）可以在4-HT存在下显著抑制PE介导的BFP-to-GFP编辑，表现出4-HT依赖性调节（图五C），这两种变体分别缩写为iA25.1和iA32.1。
图片图五 化学诱导型Acr调控CRISPR-Cas9介导的基因编辑[7]
为进一步检验iA25.1和iA32.1依赖4-HT抑制Cas9介导基因编辑的效果，研究者在HEK293T细胞中进行了T7E1测定。结果显示，这两种变体在没有4-HT的情况下对SpyCas9活性有轻微的影响，但在4-HT存在下会切换到活性状态显著抑制SpyCas9（图五D和E），此外iA32.1还可以抑制细胞中St3Cas9介导的基因编辑（图五F）。以上结果表明，iAcr表现出4-HT依赖性调控人源细胞中CRISPR-Cas9介导的基因组编辑。
综上所述，该研究组从链球菌MGEs中发现了多个新的II-A型Acr，它们以多种不同的机制抑制Cas9直系同源物。基于这些Acr，研究者开发的化学诱导型iA25.1和iA32.1，可在人源细胞中表现出4-HT依赖性地调控CRISPR-Cas9介导的基因编辑。该项工作既扩展了II-A型抗CRISPR家族蛋白的多样性，又为开发Acr相关可控基因编辑工具的策略提供了新的见解。
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