技术分享：转录偶联供体DNA可显著提高基因编辑效率
CRISPR/Cas9诱导DNA双链断裂（DSB）进而刺激同源重组（HR）修复实现基因组的精准编辑。然而，这种方法在哺乳动物细胞中精准插入或敲除大片段DNA时是低效的，因为HR修复途径效率远远低于细胞中普遍存在的非同源末端连接（NHEJ）修复途径[1, 2]。提高基因编辑效率的方法有一种是利用转录，该方法可增强HR修复。有研究表明，供体DNA的活跃转录会显著增加基因校正频率[3]。这是因为DSB周围的转录会形成包含DNA-DNA和DNA-RNA混合物的DR-loops[4]。当DSB末端被EXO1核酸酶加工成单链DNA (ssDNA)末端时，其3’突出ssDNA与新转录的RNA可短暂形成一个R-loop[6]，而这种R-loop结构会优先招募HR蛋白，促使DSB优先采用HR途径来进行修复[7, 8]。
2022年8月， Nucleic Acids Research上报道了一种转录偶联编辑器TEd，通过转录偶联的供体DNA（TC供体）实现高效的基因编辑，并且将转录的TC供体招募到DSB处可以进一步提高基因编辑效率。在哺乳动物细胞系中，TEd相比经典Cas9介导的HR编辑方法CEd，在实现大片段DNA的敲除、插入、替换以及点突变等基因编辑中效率提高约10倍以上[9]。
首先，研究者测试将HR供体与转录偶联能否提高CRISPR/Cas9介导的基因编辑效率。分别将H1启动子克隆到HR供体质粒同源臂（HA）的左侧或右侧，获得两个转录方向相反的TC供体。其中，一个供体产生与Cas9/gRNA非靶链互补的同源转录偶联RNA (TC RNA)，称为TEd/Ph（图一A）；另一个TC RNA与靶链互补，称为TEd/Ph-Rev。通过将GFP序列插入到LMNA基因的sgRNA1位点来比较TEd和CEd的编辑效率和准确性（图一B和C）。经FACS分析发现，TEd1/Ph和TEd2/Ph的GFP KI效率显著高于CEd约3-4倍（图一D），定位于核膜的GFP-Lamin融合蛋白也被成功表达（图一E）。然而，TEd1/Ph-Rev或TEd2/Ph-Rev的GFP KI效率均不高于CEd（图一D），表明TC供体的转录方向是提高GFP KI效率的关键。此外，研究者测试了由CMV启动子驱动的TEd效率，称为TEd/Pc，其KI效率高于H1启动子（图一D），表明转录活性更高的CMV启动子提高了TC供体的转录水平，进而提高了KI效率。以上结果表明，链特异性TC供体转录在LMNA基因的GFP KI中提高了至少3倍的效率，并且TC供体转录的方向是TEd进行高效基因编辑的关键。
图一 TEd基因编辑方式在哺乳动物细胞中实现高效基因敲入[9]
接下来，研究者测试TEd的基因编辑效率是否受到TC供体和DSB之间距离的限制，利用MCP-MS2系统直接将TC RNA招募到DSB处来检测对KI效率的影响。将4个噬菌体MS2插入TEd1和TEd2的TC RNA的3’端，分别获得TEd3和TEd4（图一B)，并将MCP（MS2衣壳蛋白）融合到Cas9的N端或C端，检测这些结构组合在LMNA基因位点的GFP KI效率。结果显示TEd3和TEd4的KI效率显著高于CEd（约10倍）和TEd2（约2倍）（图一D)，C端标记的MCP效率略高于N端。通过GFP的核膜定位，以及基因组PCR和TA克隆测序结果证实TEd3、TEd4和CEd均可精准编辑细胞（图一E-G)，免疫印迹分析也检测到预期大小的蛋白表达。以上结果表明，将TC RNA招募到DSB处可显著提高TEd编辑效率。此外，研究者还测试了TC供体的同源臂HA长度对HR效率的影响。结果发现，HA长度120bp的KI效率与240bp几乎相同，而小于120bp的则显示出较低的编辑效率（图一H)。以上结果表明，越长的HA可驱动越高的编辑效率，并且120bp足以实现高效的TEd编辑。
目前基因编辑面临的挑战之一是实现高效、精准地插入大片段DNA。研究者分别在HEK293T细胞的GAPDH位点和FBL位点上测试TEd KI不同长度大片段DNA（2.7~10.1kb）的效率（图二A)。结果发现，TEd4在两个位点的大片段DNA KI效率均高于CEd（图二B和C），PCR检测和GFP融合蛋白的细胞核定位确认了KI的准确性（图二D-G)。以上结果表明，对于大片段DNA，TEd相比CEd同样能够实现更加高效、精准的最多10 kb大片段DNA的基因敲入。
图二 TEd在HEK293T中实现高效的大片段DNA基因敲入[9]
研究者进一步测试TEd4的大片段DNA敲除效率，在HEK293T细胞中比较TEd4和CEd方法敲除10kb CDC42片段的效率（图三A)，PCR及测序结果显示该片段被精准敲除，且TEd4的敲除效率高于CEd（图三B)。另外，用18bp的I-SceI位点替换8kb的基因组序列（图三C)，同样显示TEd4敲除效率比CEd更高效（图三D），酶切验证I-SceI的准确替换（图三E），并且I-SceI连接处没有发现序列的插入/缺失（图三F）。同样地，用内部核糖体进入位点（IRES）-GFP片段替换8kb的基因组序列（图三G），结果也显示TEd4的基因替换效率显著高于CEd（图三H和I)，以及IRES-GFP序列的准确替换（图三J)。以上结果证明，TEd相比CEd在大片段DNA的基因敲除和基因替换上同样更为高效。
图三 TEd在HEK293T中实现高效大片段DNA的基因敲除和基因替换[9]
最后，研究者比较了TEd和CEd引入点突变的效率。设计了linker序列将mCherry与GFP融合在一起，其中linker序列中包含了一个TAG终止密码子，因而构建的mCherry–linker-GFP报告系统只表达mCherry（图四A）。当利用CRISPR系统将TAG突变为TTG，且AGG的PAM序列突变为AGT后，即可同时表达mCherry和GFP，因此可利用该报告系统评价引入点突变的效率。FACS分析发现TEd4的点突变KI效率是CEd的15倍（图四B)，荧光成像显示mCherry和GFP的共表达（图四C)，Sanger测序和NGS均验证了点突变KI的准确性（图四D-E)。此外，研究者还在疾病相关位点PRNP引入G127V突变（图四F)，结果显示TEd4的点突变KI效率是CEd的10倍（图四G-H)。以上结果表明，TEd能高效、精准地在基因组中引入点突变。
图四 TEd在HEK293T中实现高效的点突变[9]
综上所述，研究者开发的转录偶联基因编辑器TEd，通过对HR供体DNA进行改造，在HR供体DNA上引入活跃的转录并招募到DSB处，可大大提高CRISPR/Cas9介导的同源重组效率，实现哺乳动物细胞内大片段DNA的高效精准敲入、敲除、替换以及点突变，显著提高基因编辑在基础科研和临床转化应用中的编辑效率。
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参考文献
1. Chu VT, Weber T, Wefers B, Wurst W, Sander S, Rajewsky K, Kuhn R. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol 2015, 33(5):543-548.
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