技术分享：RAD51通过增强IHR显著提高纯合编辑效率
目前，CRISPR/Cas9技术成为基因编辑的首选工具。Cas9蛋白特异性切割目标DNA序列，产生DNA双链断裂（DSB），然后启动细胞内的DNA修复机制来修复DSB。DNA修复机制包括有同源重组修复（HR）和非同源末端连接（NHEJ）。利用HR修复机制，通过引入同源修复donor序列，可在DSB处引入外源DNA实现基因敲入（knockin，KI）。2016年，一项针对兔胚胎的研究表明，RS1可显著增强KI效率[1]。RS1是链交换因子RAD51的化学激动剂，而RAD51对HR至关重要。在无DNA损伤的细胞中，RAD51形成小的、酶失活的七聚环[2]。当DSB发生后，BCCIP蛋白质促进BRCA2阻断RAD51的自主装，使得RAD51富集到DSB上[3]。然后，RAD51在末端切除产生的单链突出端上形成长核丝，积极搜索同源修复序列和完成链交换[4]。
基于上述发现以及RAD51在HR修复机制中的关键作用，来自美国麻省理工学院的研究团队进一步探索RAD51在基于CRISPR/Cas9的KI事件中的作用。最终发现RAD51可以通过增强同源间修复（interhomolog repair，IHR），显著提升纯合KI效率，并用于无需外源模板的等位基因修复。该研究成果发表在2021年6月的Cell上[5]。
首先，研究者在构建自闭症相关的Chd2R1684H（c.5051G > A）点突变小鼠模型的过程中，测试添加RAD51对KI效率的影响（图一A）。Chd2R1684H小鼠是利用受精卵原核注射法来获得，利用显微注射技术将SpyCas9、crRNA、tracrRNA、ssDNA供体、以及加或不加RAD51的RNPs混合液注入受精卵原核中。重构胚胎在体外培养到桑椹胚或囊胚后进行DNA纯化、巢式PCR基因型鉴定和Sanger测序（图一B）。由于CRISPR/Cas9在小鼠受精卵发育过程中都可能进行基因编辑，该方法经常会产生基因型嵌合的个体[6]。结果显示，添加RAD51后虽然仅略微提高了获得Chd2R1684H小鼠的整体KI效率（图一C左），但是显著提高了基因型嵌合的纯合KI效率（图一C中），以及全纯合KI效率（图一C右）。研究者另外构建TyrC89S（c.265T > A）小鼠进行了同样测试（图一D），可简单通过小鼠皮肤的白化程度来快速确定F0小鼠的基因型（图一E），并经测序确定（图一F）。同样地，添加RAD51后能显著性提高基因型嵌合以及全纯合的纯合KI效率（图一G）。
图一 RAD51可提高多个位点的纯合KI效率[5]
由于RAD51对整体KI效率的提高并不明显，而是显著增加了纯合KI效率，不仅是正确基因型还包括了错误基因型的纯合效率。有研究报道Cas9造成DNA双链断裂（DSB）后可诱发胚胎IHR[7]。IHR主要发生在减数分裂时期，是指当一条染色体发生DSB后以另一条同源染色体为模板来进行修复。由此，研究者推测RAD51可能通过IHR的方式来增加纯合KI效率，设计了不使用外源供体模板的实验来进行测试。将Chd2RH/RH的雄鼠精子与野生型卵子经体外受精获得Chd2RH/+杂合受精卵，原核注射SpyCas9、crRNA、tracrRNA、以及加或不加RAD51的RNPs混合液（图二A），获得的重构胚胎进行基因型鉴定（图二B）。结果显示，不加RAD51的Cas9基因编辑后能产生Chd2RH/RH基因型，表明确实发生了IHR；添加RAD51后可显著性增加基因型嵌合以及全纯合的IHR比例（图二C）。研究者进一步利用免疫化学成像，观测到RAD51仅在雄原核与雌原核融合后的S/G2期时凝聚成小点定位于DNA上（图二D）。经统计，RAD51小点的数目在无显微注射的情况下并不存在，随着Cas9的注射而显著性增多（图二E），提示RAD51小点的形成是DSB依赖的，可在Cas9基因编辑时添加外源RAD51来促进IHR。
图二 RAD51可增加IHR且定位于Cas9诱导的DSB上[5]
接着，研究者在多条染色体的多个位点评价RAD51增强IHR的效果。除上述实验使用的位于小鼠7号染色体上的Chd2和Tyr基因，X染色体上的Mecp2基因、11号染色体上Acs16和1号染色体上Kcnb2基因的结果都显示，内源性IHR在早期小鼠胚胎中具有广谱活性，添加RAD51后可以进一步提高IHR比例（图三A-C）。经过TOPO克隆和测序分析切割位点的上下游基因组序列，IHR发生区域在不同编辑位点各不相同，长度总区间约1.5-3 kb（图三D）。
图三 RAD51增强多条染色体多个位点的IHR[5]
最后，研究者鉴定了一系列DSB修复相关蛋白是否具有增强IHR的效果。结果显示，促进HR机制的USP1/WDR48和BCCIP均能够促进IHR，而促进MMEJ的XRCC1和促进NHEJ的XRCC4均不能促进IHR。表明早期胚胎中的IHR是由典型HR途径驱动的。
综上所述，在小鼠胚胎时期，RAD51、BCCIP和USP1/WDR48可在Cas9基因编辑后产生的DSB位点上促进IHR的发生，从而显著提高纯合KI效率。这项研究可用于提高当前受精卵注射法获得纯合KI小鼠的效率，并为将来在体细胞中通过增强IHR直接修复致病突变的新型基因与细胞治疗提供了基础。
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参考文献
1. Song J, Yang D, Xu J, Zhu T, Chen YE, Zhang J: RS-1 enhances CRISPR/Cas9- and TALEN-mediated knock-in efficiency. Nature communications 2016, 7:10548.
2. Yu DS, Sonoda E, Takeda S, Huang CL, Pellegrini L, Blundell TL, Venkitaraman AR: Dynamic control of Rad51 recombinase by self-association and interaction with BRCA2. Molecular cell 2003, 12(4):1029-1041.
3. Lu H, Guo X, Meng X, Liu J, Allen C, Wray J, Nickoloff JA, Shen Z: The BRCA2-interacting protein BCCIP functions in RAD51 and BRCA2 focus formation and homologous recombinational repair. Molecular and cellular biology 2005, 25(5):1949-1957.
4. Krejci L, Altmannova V, Spirek M, Zhao X: Homologous recombination and its regulation. Nucleic acids research 2012, 40(13):5795-5818.
5. Wilde JJ, Aida T, Del Rosario RCH, Kaiser T, Qi P, Wienisch M, Zhang Q, Colvin S, Feng G: Efficient embryonic homozygous gene conversion via RAD51-enhanced interhomolog repair. Cell 2021, 184(12):3267-3280 e3218.
6. Jiang J, Zhao AQ, Xie T, Chen SW, Li JS: Construction of genome-wide protein tagging cell and mouse libraries. Yi chuan = Hereditas 2021, 43(7):704-714.
7. Wu Y, Liang D, Wang Y, Bai M, Tang W, Bao S, Yan Z, Li D, Li J: Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell stem cell 2013, 13(6):659-662.
