技术分享：基于Cas12a的病毒分子诊断新方法sPAMC
近几十年来，许多病毒引起了大规模爆发流行性疾病，如严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（SARS-CoV）[1]，中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）[2]，艾滋病毒（HIV）[3]以及当前全球爆发的新型冠状病毒（SARS-CoV-2，COVID-19）[4]等。及时有效地发现患者并给予治疗是遏制流行性病毒传播的有效手段。
逆转录实时定量PCR（RT-qPCR）是应用最为广泛的病毒检测“金标准”。然而，检测耗时较长且依赖于昂贵的设备限制了其检测速率[5]。由重组酶聚合酶扩增技术（RPA）[6]和环介导等温扩增技术（LAMP）[7]介导的快速恒温DNA扩增反应，由于不需要特殊温控设备，可以真正实现便携式的快速核酸检测。基于RPA或者LAMP技术与CRISPR/Cas系统相结合，加快推进了下一代分子诊断技术的发展。例如新一代核酸检测方法SHERLOCK[8]和DETECTR[9]，已被开发用于新冠病毒的临床检测。但是这些方法需要分两步进行，先进行目标序列的RPA或LAMP扩增，再进行CRISPR/Cas的检测，而多个处理步骤增加了检测时间和交叉污染的风险[10, 11]。进而，SHERLOCK被开发为单管法STOPCovid[12]和一步法SHINE[13]来简化步骤，但是灵敏度仍低于RT-qPCR，并且总反应时间约为1小时。因此，探索快速、敏感、便捷的分子诊断方法对于抗击病毒的传播至关重要。
2022年3月，Nature Biomedical Engineering上报道了一种基于Cas12a的病毒分子诊断新方法sPAMC（for suboptimal PAM of Cas12a-based test with enhanced flexibility, speed, sensitivity and reproducibility）[14]。sPAMC单管法利用非典型次优PAM基序来介导Cas12a的激活与荧光探针的切割，通过平衡Cas12a的顺式切割与旁侧切割的活性动力学，使得检测新冠病毒的反应时间缩减为20分钟，敏感性为94.2%，特异性为100%。并且sPAMC单管法相比RT-qPCR，无需提取RNA和特殊温控仪器，灵敏度也相当，为1cp/μl。
研究者在改进基于RPA和Cas12a的单管法检测新冠病毒的过程中，意外地发现针对一些非典型PAM基序设计的Cas12a-crRNA在单管法反应中灵敏度显著高于典型PAM基序（TTTV）。研究者将同个靶序列的PAM基序进行突变，发现虽然Cas12a对典型PAM基序TTTG的旁侧切割活性高于非典型PAM基序GTTG（图一a），但是在单管法反应中非典型的GTTG信号更优（图一b）。另外，在单管法反应的灵敏度测试中，发现非典型的GTTG可检测到最低靶序列浓度为2.34 fM（图一c），而典型的TTTG最低仅能检测到234 fM（图一d）。因此，非典型的PAM基序可将检测效率提高约100倍，并大大缩短反应时间。
图一 非典型PAM基序在单管法反应中显著优于典型PAM基序[14]
接着，研究者发现采用非典型PAM基序GTTG的单管法反应可获得与单独RPA反应一致的靶序列DNA扩增量，而典型TTTG的靶序列DNA扩增缓慢（图二a）。另外，典型TTTG可介导Cas12a更快速的靶序列顺式切割（图二b），以及更强的靶序列结合能力（图二c）。结果表明，靶序列的RPA扩增与Cas12a的顺式切割存在相互竞争。最终的检测信号可依靠靶序列扩增产生足够的底物，用于Cas12a的激活以及后续旁侧切割活性。
图二 单管法反应中存在靶序列的RPA扩增与Cas12a顺式切割竞争[14]
研究者进一步突变一系列的PAM基序来评价其对Cas12a的顺式切割活性与单管法反应时间的影响。结果显示，典型PAM基序虽然介导Cas12a的顺式切割活性最高，但在单管法反应中耗时较长（图三a，黑点）；表现佳的非典型PAM基序虽然顺式切割活性适中，但大大缩短了单管法反应时间（图三a，红点）；还有一部分表现差的非典型PAM基序由于顺式切割活性太低，导致单管法反应耗时最长（图三a，蓝点）。结果表明，Cas12a对部分非典型PAM基序的靶序列结合亲和力降低，激活适当的Cas12a顺式切割活性，促进单管法反应的平衡从原先的顺式切割转向为RPA扩增；使得靶序列DNA充分扩增产生足够的激活底物，进而激活Cas12a的旁侧切割活性，使得荧光探针被充分切割释放荧光信号；最终大大提高了单管法核酸检测的灵敏度，并且显著缩短了反应时间（图三b）。经统计发现，sPAMC单管法中非典型PAM基序VTTV的表现最佳，TCTV次之，后续可针对这两种非典型次优PAM基序来设计crRNA。
图三 sPAMC单管法提高灵敏度与检测速度的原理图[14]
在开发特定病毒分子诊断的实际应用中，研究者先选择一种DNA病毒的人巨细胞病毒（HCMV）进行sPAMC单管法测试。结果显示，sPAMC单管法检测HCMV的最低病毒拷贝数为24（图四a），灵敏度与RT-qPCR相当（图四b）。sPAMC单管法同样可通过添加不同的荧光探针来实现UV荧光信号检测或者侧向层析可视化检测（图四c）。反应15分钟后，拷贝数24的最低可检测病毒实验组可经紫外照射检测到明显阳性信号（图四d）。侧向层析可视化检测的灵敏度会低些，最低仅能检测到Ct值为33-34的病毒样本（图四e）。因此，研究者后续仅利用sPAMC单管法的UV检测来开发特定病毒的分子诊断方法。
图四 sPAMC单管法用于HCMV检测[14]
最后，研究者采用sPAMC单管法来开发新冠病毒的分子诊断方法。基于表现最优的三种非典型次优PAM基序VTTV、TTVV和TCTV可设计出更多的crRNA用于试剂盒的开发（图五a）。研究者将基于RPA/Cas12a/非典型次优PAM的sPAMC和基于LAMP/Cas12b的STOPCovid进行头对头比较实验，发现sPAMC在DNA和RNA的最低检测浓度（图五b）和检测时间（图五d）上都显著优于STOPCovid（图五c和e）。在新冠病毒鼻咽拭子104份阳性样本和100份阴性样本的临床测试结果中，sPAMC的敏感性为94.2%，特异性为100.0%（图五f-h）。sPAMC最低可检测到RT-qPCR的Ct值为35.8的样本，并且所有阳性样本在15分钟的反应时间都出现了阳性信号（图五g）。相比之下，STOPCovid.v1无法稳定检测Ct值在31.0以上的样品，灵敏度为78.8%。此外，sPAMC的新冠病毒检测与其他常见病毒没有交叉反应，特异性好。
图五 sPAMC单管法用于新冠病毒检测[14]
综上所述，sPAMC单管法是一种具有快速、高灵敏度、高可靠性和灵活性相结合的Cas12a介导的核酸检测方法，可快速用于开发各种特定病毒核酸的即时检验（POCT），并可开发核酸检测试剂盒用于实验室以外护理点的快速病毒诊断。
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