技术分享：安全性升级版单碱基编辑器TaC9-ABE/CBE

Tips：在“基因治疗小鼠常染色体隐性耳聋模型”技术分享中我们介绍了利用AAV递送CBE碱基编辑器进行小鼠常染色体隐性耳聋模型的基因治疗研究。本期将分享安全性升级版单碱基编辑器TaC9-ABE与TaC9-CBE。

单碱基编辑器包括胞嘧啶碱基编辑器（CBE）、腺嘌呤碱基编辑器（ABE）、鸟嘌呤编辑器（GBE）和先导编辑器（Prime Editor）。这些单碱基编辑器不会产生DNA双链断裂（DSB），在基因治疗单基因点突变遗传病方面展现出巨大的应用潜力。其中ABE可高效实现从腺嘌呤（A）到鸟嘌呤（G）的单碱基转变，目前效率最高且应用最广的是ABE7.10版本TadA-TadA^*-nCas9[1]。ABE7.10是将野生型tRNA腺嘌呤脱氨酶TadA和经过定向进化的突变体TadA^*形成的异二聚体与nCas9（SpCas9 D10A突变体）相融合。其工作原理是在sgRNA的引导下，ABE7.10结合到靶向基因组DNA位点上，由nCas9解开双链DNA（dsDNA）并在目标位点产生单链缺口，再由脱氨酶异二聚体将非靶向单链DNA（ssDNA）上一定范围内的A脱氨变成肌苷（I），然后I再转变成G，从而实现A到G的单碱基转变[1]。由于ABE7.10系统仍然利用sgRNA来引导靶位点的识别，而设计的sgRNA可能会与非靶位点序列形成错配产生脱靶效应，这将导致该系统应用于基因治疗时可能引发安全性问题。

2022年3月，Cell Discovery上发表了一种改良版腺嘌呤碱基编辑器TaC9-ABE，可有效避免sgRNA带来的脱靶效应，进一步升级了单碱基编辑的安全性[2]。研究者将脱氨酶异二聚体利用转录激活因子样效应器（transcription activator-like effector, TALE）导航到靶位点，构建TadA-TadA^*-TALE（TadA^wt*-TALE）。由于TadA^wt*-TALE无法解开dsDNA，在结合位点上没有碱基编辑活性，因而TaC9-ABE系统还需要单独表达nCas9系统（图一a）。在On-target靶位点上，sgRNA招募nCas9产生单链缺口，TadA^wt*-TALE识别经nCas9切割后的ssDNA进行A到G的单碱基转变。在非靶位点的gRNA-OFF target上，仅有nCas9产生单链缺口，缺少了脱氨酶，无法进行碱基替换；而在非靶位点的TALE-OFF target上，仅有脱氨酶同样无法对dsDNA进行碱基编辑（图一b）。因此，TaC9-ABE系统可有效避免脱靶效应。

图一 无脱靶效应的高效单碱基编辑器TaC9-ABE[2]

研究者设计实验对TaC9-ABE进行测试，并与ABE7.10系统进行比较。结果表明，TaC9-ABE与ABE7.10系统的A到G碱基编辑效率相当；其中将sgRNA和TALE的靶位点设计相隔10 bp的方案更优，编辑效率高于相隔6 bp组；而单个组份的阴性对照没有检测到编辑效率。另外，元件的其它排列设计方案的编辑效率均低于TaC9-ABE，从而确定了该系统的最优元件排布组合（图一c）。接着，研究者摸索sgRNA和TALE的靶位点设计规律。在AAVS1位点的测试结果表明，sgRNA和TALE的靶位点设计相隔6 bp到12 bp可实现有效编辑；其中相隔11 bp组的有效编辑窗口为A4到A9，优于ABE7.10系统；而相隔6 bp组的有效编辑窗口为A5到A7（图一d和e）。在另一个HEK2位点上也显示相似的结果（图一f和g）。

研究者进一步在兔胚胎中测试TaC9-ABE系统的在体编辑能力。在OTC-1位点，TaC9-ABE（6 bp）将编辑位点限定在A6，而ABE7.10同时将A6和A9转换为G。在DMD位点，TaC9-ABE（6 bp）和ABE7.10一样，将编辑位点限定在A5和A7（图一h）。上述结果证明了TaC9-ABE的高效在体碱基编辑能力，可用于产生特定点突变动物模型。最后，研究者测试了TaC9-ABE系统的脱靶效应，对40个gRNA依赖的脱靶位点（C9DOTs）以及25个TALE依赖的脱靶位点（TaDOTs）进行深度测序均未检测到脱靶编辑现象，而ABE7.10系统检测到约50%的非靶向位点存在脱靶编辑现象（图一i）。上述结果证明了TaC9-ABE系统的安全优越性，在保留高效碱基编辑能力的同时，还能避免sgRNA造成的脱靶效应。

研究者采用相同的策略也对CBE系统的第三代版本BE3进行安全性升级，构建了新型碱基编辑器TaC9-CBE，文章在2022年4月在线发表在Molecular Therapy [3]。研究者将BE3系统中的胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1（rA1）利用TALE导航到靶位点（rA1-TALE），结合nCas9-2×UGI构成TaC9-CBE系统，可高效实现从C到T的单碱基转变（图二）。后续研究者进一步将rA1换成其突变体YE1，采用YE1-TALE与nCas9-2×UGI组合来构成TaC9-CBE^YE1系统，sgRNA和TALE的靶位点设计相隔6 bp到15 bp可实现高效编辑。

图二 单碱基编辑器TaC9-CBE的工作原理示意图[3]

综上所述，研究者采用Cas9和TALE的双导航系统来共同定位和激活TaC9-ABE与TaC9-CBE碱基编辑器，可有效降低两个导航系统带来的脱靶效应，提高基因治疗的安全性。但值得注意的是，原ABE和CBE系统本身元件较大，都需要拆分到2个AAV包装体系中，在临床应用中会降低编辑效率。而安全性升级版的TaC9-ABE和TaC9-CBE系统由于增加了TALE元件，因此它们临床应用的实际编辑效率有待研究证明。

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参考文献

1. Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR: Programmable base editing of A.T to G.C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 2017, 551(7681):464-471.

2. Liu Y, Zhou J, Lan T, Zhou X, Yang Y, Li C, Zhang Q, Chen M, Wei S, Zheng S et al: Elimination of Cas9-dependent off-targeting of adenine base editor by using TALE to separately guide deaminase to target sites. Cell discovery 2022, 8(1):28.

3. Zhou J, Liu Y, Wei Y, Zheng S, Gou S, Chen T, Yang Y, Lan T, Chen M, Liao Y: Eliminating predictable DNA off-target effects of cytosine base editor by using dual guiders including sgRNA and TALE. Molecular Therapy 2022.