技术分享：新型一体化条件性敲除系统

当我们研究某个基因时，通常最先采用条件性敲除（cKO）策略来阐明其功能，利用同源重组的方法将loxP或FRT序列引入目标基因组中。然而，传统cKO细胞的制备往往需要几个月的时间。简单来说，在首轮二倍体细胞打靶完成后，若为单拷贝打靶成功，还需要在基因组上删除选择性标记后，以相同方式再次靶向另一个等位基因进行打靶。为了缩短这些复杂耗时的过程，有研究者通过TALEN技术将loxP序列同时整合至两个等位基因中[1]，或使用CRISPR/Cas9系统介导Cre调控的可逆基因诱捕方法[2, 3]一步法生成cKO胚胎干细胞（ESCs）。但这些方法仍然需要大规模药筛来分离阳性cKO克隆，且无法对靶基因进行标记和监测。

2021年1月，Nucleic Acids Research杂志上报道了一种用于基因功能研究的新型一体化条件敲除系统，可以高效地构建cKO细胞并同时进行目的基因修饰，包括标签蛋白标记和报告基因敲入，从而仅需一株cKO细胞即可实现目的基因的多种一体化功能研究[4]。

研究者选择Ddx1基因作为研究对象，sgRNA设计在2号外显子上，利用CRISPR/Cas9系统定点插入FRT-EGFP-FRT-P2A-Flag-Exon1&2 CDS元件（图一A左图）。生理条件下，利用Ddx1内源启动子驱动EGFP的表达，P2A隔开EGFP和Ddx1蛋白序列，在Ddx1蛋白的N端引入Flag tag，并补上sgRNA插入位点前的Exon1和部分Exon2 CDS序列，从而恢复Ddx1的全长蛋白序列。KO条件下，导入FLP重组酶，去除EGFP序列的同时造成后续序列的移码突变，快速实现Ddx1 KO（图一A右图）。

图一 一体化条件性敲除系统的工作原理[4]

cKO细胞打靶过程中，可利用EGFP的表达来快速筛选单克隆，再利用PCR测序来确定阳性cKO克隆（图一B和表一）。阳性cKO细胞系可用于一体化功能的研究：一、可利用EGFP来指示目的基因的表达情况；二、引入FLP重组酶实现KO，用于目的基因功能研究；三、利用Flag tag来进行IP-MS、RIP、ChIP、IHC等生化实验和组学分析，进一步研究目的基因生理功能（图一C）。

研究者在ESCs中靶向多个目的基因构建一体化cKO细胞系，打靶效率的统计结果见表一。若细胞打靶后随机挑选单克隆进行PCR鉴定，基因编辑的阳性率仅为4%~26%。而改换成挑选EGFP阳性单克隆，可使基因编辑的阳性率达到100%，从而将双等位基因阳性的cKO打靶效率提升到63%和83%（表一）。

表一 一体化cKO细胞的阳性打靶效率统计[4]

利用该系统，研究者发现Ddx1 KO的ESCs细胞增殖被严重阻滞（图二A），TUNEL阳性凋亡细胞的比例显著增加（图二B）。诱导Ddx1 KO 2-3天，可检测到p53蛋白的显著上调（图二C），以及p53下游通路的Cdkn1a、Perp、Fas、Pmaip1、Plk2、Mdm2的mRNA表达水平显著升高（图二D）。以上表明Ddx1的缺失可迅速激活p53信号通路。后续研究者对其机制进行了深入研究。

图二 Ddx1^−/−ESCs的增殖阻滞[4]

综上所述，这种一体化条件性敲除系统不仅可以一步到位地构建cKO细胞，还可以对目的基因进行标签标记和荧光标记。该系统可简化cKO细胞建系过程，缩短建系时间，提高打靶效率，并集合多种功能的研究手段于一体，为快速和精确分析目的基因的表达与功能提供了一个重要的工具。

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参考文献

1. Flemr M, Buhler M: Single-Step Generation of Conditional Knockout Mouse Embryonic Stem Cells. Cell Rep 2015, 12(4):709-716.

2. Chen L, Ye Y, Dai H, Zhang H, Zhang X, Wu Q, Zhu Z, Spalinskas R, Ren W, Zhang W: User-Friendly Genetic Conditional Knockout Strategies by CRISPR/Cas9. Stem Cells Int 2018, 2018:9576959.

3. Andersson-Rolf A, Mustata RC, Merenda A, Kim J, Perera S, Grego T, Andrews K, Tremble K, Silva JC, Fink J et al: One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nat Methods 2017, 14(3):287-289.

4. Suzuki T, Katada E, Mizuoka Y, Takagi S, Kazuki Y, Oshimura M, Shindo M, Hara T: A novel all-in-one conditional knockout system uncovered an essential role of DDX1 in ribosomal RNA processing. Nucleic Acids Res 2021, 49(7):e40.