技术分享：体外重建DMD疾病的神经肌肉回路
杜氏肌肉营养不良症（DMD）是一种致死性的X连锁隐性遗传病，由抗肌萎缩蛋白（dystrophin，DMD）基因的各种突变所致，常见于男性儿童的遗传性神经肌肉紊乱，一般表现为骨骼肌萎缩和无力，最终因呼吸循环衰竭而死亡[1]。生理状态下，运动神经元轴突末梢与骨骼肌纤维形成突触连接，即神经肌肉接头（NMJs）。神经肌肉回路由运动神经元（MNs）释放神经递质至NMJs，引起骨骼肌收缩。抗肌萎缩蛋白糖蛋白复合物（DGC）富集在肌纤维和NMJs的细胞膜上，负责连接细胞骨架和细胞外基质来维持骨骼肌细胞的完整性，并参与细胞信号传导[2, 3]。研究表明，DMD病人与dystrophin基因缺陷小鼠的NMJs结构发生改变，出现异常电生理信号[4-7]。但是NMJs结构的异常对于DMD的病理学影响尚不清楚。
2021年9月，Science Advances杂志发表了一种体外重建神经肌肉回路的微型装置，结合DMD病人多能干细胞（ePSC）的分化系统，进一步研究NMJs在DMD疾病中的作用，并提供了一种体外筛药系统[8]。
研究者首先建立了DMD病人来源的多能干细胞（ePSC），并利用CRISPR-Cas9技术修复DMD杂合突变c.10141C>T（p.R3381X），进而在体外分化为肌细胞（图一A）。建立的DMD ePSC可高表达5种多能性marker（图一B），并可分化成三种胚层细胞（图一C）。将DMD ePSC利用CRISPR-Cas9技术修复成CORR-ePSC，测序结果表明已正确修复（图一E-G）。而且DMD ePSC和CORR-ePSC细胞的核型均表现正常（图一D和H）。
图一 建立DMD ePSC与突变修复CORR-ePSC细胞系[8]
接着，研究者将DMD ePSC和CORR-ePSC在体外定向分化成肌细胞。先将DMD ePSC和CORR-ePSC分化为成肌祖细胞（MPCs）（图二A），再进一步分化为肌管（图二B和C）。可以观察到CORR-ePSC与DMD ePSC相比，体外分化效率更高（图二C），还可检测到基因修复后DMD全长蛋白的重新表达（图二D）。
图二 DMD ePSC和CORR-ePSC定向分化为肌管[8]
随后，研究者搭建微型装置在体外重建神经肌肉回路。将DMD ePSC和CORR-ePSC分化得到的MPCs作为肌肉来源，小鼠胚胎干细胞（ESCs）分化得到的运动神经元（MNs）和星形胶质细胞（ACs）作为神经来源，利用分区装置共培养上述细胞来重建神经肌肉回路（图三C）。先将小鼠ESCs在体外单独分化为MNs和ACs（图三A），第-2天，将表达光传感器的ChR2-MNs和ACs的细胞球体植入微型装置的上下两个腔室中。第-1天，将DMD ePSC或CORR-ePSC分化得到的MPCs植入微型装置的中间腔室，然后用纤维蛋白/基质水凝胶密封（图三B和C）。在第0-3天分化过程中，DMD MPCs组和CORR-MPCs组都出现神经元轴突生长，MPCs分化成肌纤维，互相作用形成突触连接（图三D和E）。从第4-5天开始，每天照射1小时蓝光（470nm），诱导ChR2-MNs神经元激活，从而刺激肌纤维收缩，实现神经肌肉回路的体外重建（图三B）。结果表明，DMD MPCs组和CORR-MPCs组相比，肌纤维的收缩频率和强度显著降低（图三F和G）；神经突触前marker突触囊泡糖蛋白2A（SV2）和肌纤维marker TUBB3并没有显著差别（图三H和I）；可是神经突触后marker乙酰胆碱受体（AChR）显著减少（图三H和I）。由于NMJs的数量是由SV2和AChR的共定位来确定的，因此DMD病人的NMJs数量显著减少可能是导致肌纤维收缩受阻的原因之一。
图三 微型装置体外重建神经肌肉回路[8]
最后，研究者利用这个微型装置系统来进行体外筛药，发现TGFβ信号通路抑制剂（SB-431542）可显著提高DMD MPCs组的肌纤维收缩频率和强度（图四）。
图四 SB-431542有效改善DMD的肌肉收缩缺陷[8]
综上所述，研究者建立了一种神经肌肉回路的体外重建微型装置，揭示了NMJs结构对DMD疾病的影响，并为靶向NMJs来治疗DMD疾病提供了新思路和体外筛药系统。
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