技术分享：利用合成致死来控制单一性别子代出生以及性别特异表型
合成致死这一现象于1922年由哥伦比亚大学遗传学家Calvin Bridges在模式生物黑腹果蝇中发现，当两个特定基因同时突变失活时会造成果蝇死亡，而这两个基因单一纯合突变的亲本都不致死[1]。1946年，合成致死的概念被Theodore Dobzhansky提出[2]，而这一概念后来被广泛用于癌症治疗和各种研究中。
2021年12月，Nature Communications上发表了一项利用合成致死概念来控制单一性别子代出生的技术，该技术可在特定性别的科学研究中提高动物福利，并可拓展应用到畜牧业上[3]。研究者设计了双组分的CRISPR-Cas9系统，其中一个组分设计在性染色体上，另一个组分选择了Top1基因作为致死靶点。Top1基因编码的拓扑异构酶I是进化保守的DNA复制和修复重要因子，小鼠Top1基因的缺失会造成4-16细胞时期的胚胎致死[4]。
研究者首先测试了Top1基因的致死效果，将突变效率最高的Top1 sgRNA2序列敲入常染色体安全位点Hipp1(H11)，构建携带U6-Top1 sgRNA2-pCbh-mCherry的H11Top1转基因小鼠（图一a）。打靶成功的H11Top1小鼠全身呈红色荧光（图一b）。H11Top1杂合雄鼠与持续性过表达Cas9的Rosa26Cas9（简称R26Cas9）纯合雌鼠进行交配，子代中同时携带H11Top1/R26Cas9基因型的胚胎即致死，而+/R26Cas9基因型则可正常存活（图一c）。在子代E3.5胚胎中，可以检测到H11Top1/R26Cas9基因型占比为50%，但子代出生后仅有+/R26Cas9基因型存活（图一d）。并且在子代H11Top1/R26Cas9基因型的E3.5胚胎中，确实检测到高比例的Top1基因突变（图一e）。该结果成功证明了Top1基因的高效致死性。
图一 H11Top1小鼠的构建与合成致死效果检测[3]
接着研究者将Cas9元件敲入性染色体来实现性别特异的合成致死。X染色体的敲入位点选择在Hprt基因，该基因缺失对小鼠的造血系统和生育能力基本无影响[5]。Y染色体的敲入位点选择在Uty基因，该基因不是生育必需[6]，且在雄鼠成体组织中均有表达[3]。研究者在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中，将Hprt基因的2号外显子中敲入pCAG-Cas9-T2A-eGFP元件，获得X染色体过表达Cas9的XCas9mESCs（图二a）。由于野生型小鼠Uty基因的18号外显子不表达，为了不破坏Uty基因的功能，研究者在17号外显子后面直接敲入19-30号外显子的cDNA序列，从而敲入cDNA19-30-IRES-Cas9-T2A-eGFP元件，获得Y染色体过表达Cas9的YCas9mESCs（图二b）。将mESCs进行囊胚注射获得嵌合小鼠，通过与野生型小鼠交配分别获得生殖系遗传的XCas9小鼠和YCas9小鼠。后续实验均选择雄鼠来进行，即XCas9Y与XYCas9，这样交配获得的子代可以保证仅有雌鼠携带XCas9，以及仅有雄鼠携带YCas9。经蛋白表达水平检测，在XCas9Y与XYCas9雄鼠的成体组织中均能检测到Cas9蛋白的表达（图二c和二d）。
将XCas9Y雄鼠与纯合H11Top1雌鼠交配，获得的子代中仅雄鼠存活，基因型为H11Top1/Y，而H11Top1/XCas9基因型的雌鼠全部胚胎致死（图二e，左图）。而将XYCas9雄鼠与纯合H11Top1雌鼠交配，获得的子代中仅雌鼠存活，基因型为H11Top1/X，而H11Top1/YCas9基因型的雄鼠全部胚胎致死（图二e，右图）。子代的性别分析也证实了该系统可高效控制单一性别子代的出生（图二f）。
图二 性染色体特异的XCas9和YCas9小鼠的构建与控制单一性别子代出生率检测[3]
研究者进一步将该系统运用于性别特异的表型分析，选择了重要的DNA修复基因Atm来进行测试。将XCas9Y与XYCas9雄鼠分别与野生型雌鼠交配获得受精卵，利用电转将Atm sgRNA导入受精卵中后进行胚胎移植。XCas9Y雄鼠获得的F0子代仅有雌性子代携带Atm突变，并且在8周龄检测出现卵巢萎缩（图三a），以及无卵母细胞产生的表型（图三b）。该方法XYCas9雄鼠获得的F0子代仅有雄性子代携带Atm突变，并且在8周龄检测出现睾丸生精小管中无精子（图三c），以及睾丸变轻的表型（图三d）。免疫荧光染色分析显示粗线期精母细胞的染色体断裂以及持续性的DNA损伤（图三e）。
图三 性别特异的Atm突变表型分析[3]
综上所述，研究者利用CRISPR-Cas9来设计双组分合成致死系统，并且利用性染色体特异表达的Cas9来控制单一性别子代出生，以及进行性别特异的表型分析。
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参考文献
1. Bridges CB: The origin of variations in sexual and sex-limited characters. Am Nat 1922, 56:51-63.
2. Dobzhansky T: Genetics of Natural Populations .13. Recombination and Variability in Populations of Drosophila-Pseudoobscura. Genetics 1946, 31(3):269-290.
3. Douglas C, Maciulyte V, Zohren J, Snell DM, Mahadevaiah SK, Ojarikre OA, Ellis PJI, Turner JMA: CRISPR-Cas9 effectors facilitate generation of single-sex litters and sex-specific phenotypes. Nat Commun 2021, 12(1)6926.
4. Morham SG, Kluckman KD, Voulomanos N, Smithies O: Targeted disruption of the mouse topoisomerase I gene by camptothecin selection. Mol Cell Biol 1996, 16(12):6804-6809.
5. Ansell JD, Samuel K, Whittingham DG, Patek CE, Hardy K, Handyside AH, Jones KW, Muggleton-Harris AL, Taylor AH, Hooper ML: Hypoxanthine phosphoribosyl transferase deficiency, haematopoiesis and fertility in the mouse. Development 1991, 112(2):489-498.
6. Shpargel KB, Sengoku T, Yokoyama S, Magnuson T: UTX and UTY demonstrate histone demethylase-independent function in mouse embryonic development. PLoS genetics 2012, 8(9):e1002964.