技术分享：“出乎意料”的基因编辑错误

在CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑中，要实现精准基因编辑需要三个关键步骤，即精准识别，精准切割和精准修复。若其中任一环节发生“意外”，那么将无可避免地发生错误编辑。尽管CRISPR-Cas9技术已广泛应用于多个物种，科学家们已能很好地掌控前两个关键步骤即精准识别和精准切割，但由于第三个精准修复步骤是由细胞自行选择DNA损伤修复机制来完成，主要包括同源修复（HDR）与非同源末端连接（NHEJ）修复等，因此总会出现各种“意外”。编辑完成后，科学家们从中筛选出精准基因编辑的产物用于后续研究实验。

2020年在Science Advance杂志上发表了一篇文章，描述了利用精准基因编辑的常规阳性筛选方法，意外地发现了一种DNA片段串联重复的错误产物，然而这一错误不容易被发现，从而导致错误研究结果[1]。研究者是利用CRISPR-Cas9技术进行受精卵注射，构建条件性敲除（CKO）小鼠模型时发现该现象。研究者将sgRNA、Cas9和Donor序列一起注射到小鼠受精卵中（图一A），获得鼠尾PCR鉴定阳性的F0小鼠（图一B）。由于该方法获得的阳性F0小鼠是基因型嵌合小鼠，因此F0小鼠还需要与野生型小鼠进行交配，从而获得基因型阳性的F1小鼠用于科学研究。但是研究者在F1小鼠的鉴定过程中，发现了DNA片段头尾串联重复的错误产物（图一C-F）。虽然这种错误产物在F0小鼠中也高频出现，可是科学家们往往仅关注阳性F0小鼠，没有在意错误产物的类型。由于F0小鼠是基因型嵌合小鼠，因此在生殖系遗传的过程中部分错误基因型也会被遗传至F1小鼠中。而同时这种DNA片段头尾串联重复的错误产物极易出现PCR假阳性结果，所以假如没有对F1小鼠进行严格的检测，往往容易忽视这种错误。

图一 精准修复过程中的“意外”编辑[1]

研究者汇总了构建6个基因的10组CKO小鼠模型的数据（表一），共计检测到基因型正确的F0小鼠54只，将这些F0小鼠与野生型小鼠交配共获得了322只F1小鼠。其中F1小鼠中，基因型正确的单拷贝（SC）阳性小鼠共63只，占F1小鼠总数的19.6%。而出现多拷贝串联（MC）的错误基因型小鼠共83只，占比为25.8%。并且研究者直接在5只F0阳性小鼠中也检测到多拷贝串联的存在。值得注意的是，注射的Donor序列无论是双链DNA（dsDNA）或单链DNA（ssDNA）的形式，还是模板长度的不同均会出现多拷贝串联的错误基因型小鼠。

表一 构建6个基因CKO小鼠模型的结果汇总[1]

综上所述，利用CRISPR-Cas9技术进行受精卵注射获得基因编辑小鼠的方法，在第一轮对F0小鼠进行严格检测获得基因型正确的F0小鼠后，仍然会在F1小鼠中出现多拷贝串联的错误基因型，并且该错误基因型比例高于精准编辑基因型。这一现象值得引起科学家们的重视，在往后的研究中仍然需要对该方法获得的F1小鼠进行严格鉴定，不能简化小鼠检测流程。

GTP研发中心采用的“人造精子细胞”介导的半克隆技术[2]，是在体外细胞水平上完成基因编辑，获得基因型正确的单克隆“人造精子细胞”。然后将“人造精子细胞”像精子一样，注射到卵母细胞中就可以一步法“受精”获得基因改造小鼠。获得的F0小鼠全部为基因型正确的杂合小鼠，从而保证F1小鼠的阳性率可达50%。该方法构建过程简便，只需要“人造精子细胞”单克隆的基因型检测正确，即可保证后续小鼠基因型的唯一性，无需复杂繁琐的小鼠鉴定流程实验结果更加真实可靠。

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参考文献

1. Skryabin BV, Kummerfeld DM, Gubar L, Seeger B, Kaiser H, Stegemann A, Roth J, Meuth SG, Pavenstadt H, Sherwood J et al: Pervasive head-to-tail insertions of DNA templates mask desired CRISPR-Cas9-mediated genome editing events. Sci Adv 2020, 6(7).

2. 蒋婧, 赵安麒, 谢甜, 陈淑藯, 李劲松: 全基因组蛋白质的标签细胞和小鼠资源库建设. 遗传. 2021, 43(07):704-714.