技术分享：人源化FXII基因敲入小鼠模型的构建——可用于抗血栓药物的测试
血液凝固对于止血至关重要。在生理病理条件下，过度凝血会引发缺血性疾病的症状，如心肌梗死、肺栓塞和缺血性中风等，甚至危及生命。目前可用的抗凝剂和抗血栓剂虽然有助于预防缺血性心脑血管疾病，但是通常伴随着增加出血的风险。
抑制凝血因子XII（FXII）的表达可有效抑制血栓形成而不产生出血风险，使得它成为一个有前景的抗血栓靶点。在聚阴离子的介导下（例如体内的多磷酸盐、核酸，或体外的二氧化硅、鞣花酸），FXII被激活为FXIIa，进一步启动内在凝血级联反应，从而形成纤维蛋白促进凝血。FXII驱动的接触系统激活与各种疾病有关，包括遗传性血管性水肿（HAE）、阿尔茨海默病以及血栓性和炎症性疾病[1]。这种接触激活过程是活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）的基础，临床上APTT被广泛用于测定血浆的凝固。临床上FXII的遗传缺陷与异常出血无关[2]。与人类相似，FXII敲除小鼠不会发生自发性出血，出血时间也不会延长，但是可防止病理性血栓形成和血栓性炎性脑梗塞[3, 4]。FXII作为一个有前景的新靶点，目前仍然缺乏人源化FXII动物模型来进行新研发药物的体内有效性和安全性评价。
2021年8月，德国伍尔茨堡大学医院实验生物医学研究所的Bernhard Nieswandt研究组构建了一种人源化FXII基因敲入小鼠模型（hF12KI），将鼠源F12基因的整个序列替换为人源F12基因序列，并利用该模型进行了FXIIa人源抗体的小鼠体内评价实验，为FXII(a)小分子抑制剂的研发提供了有效的体内评价系统[5]。
研究者首先对hF12KI小鼠模型进行检测，利用蛋白质印迹分析可在hF12KI小鼠血浆中检测到人源hFXII蛋白质的表达（~68kDa）（图一A）；ELISA检测hF12KI小鼠中不存在鼠源mFXII（图一B），仅特异性表达hFXII（图一C）；LC-MS检测也同样证明了hF12KI小鼠仅表达hFXII（图一D和E），但是小鼠血浆中的hFXII含量与人血浆相比减少了许多，仅为20%的含量（图一D），这可能与人源F12基因调节元件在小鼠体内识别效率低有关。尽管如此，hF12KI小鼠与WT小鼠相比，APTT仍然保持相似（图一F），这与之前报道的仅有10%的FXII足以维持正常APTT的结论一致[6]。但是由于hFXII含量的减少导致了hF12KI小鼠的凝血活性显著降低（图一G），而凝血酶原时间PT指标没有显著变化（图一H）。研究者进一步评估了FXIIa人源单克隆抗体（mAB）3F7的浓度对hF12KI小鼠凝血作用的影响。hF12KI小鼠与WT小鼠相似，APTT表现出剂量依赖性时间延长（图一I），并且100 µg/ml 的3F7足以将FXIIa蛋白酶活性降低至5%以下（图一J）。而多达0.5 mg/ml的3F7给药也不影响hF12KI小鼠与WT小鼠的凝血酶原时间PT指标（图一K），再次证明了3F7抑制FXIIa介导凝血作用的特异性[7]。值得注意的是，hF12KI小鼠中的低hFXII表达可能使其对FXII抑制剂的抗血栓作用更为敏感。
图一 hF12KI小鼠模型鉴定与单克隆抗体3F7的体内评价实验[5]
为了进一步测试hF12KI小鼠的体内功能，研究者进行了FeCl3诱导的肠系膜小动脉血栓形成实验，hF12KI小鼠与WT小鼠相似，在15-17分钟时均可形成血管闭塞；而hF12KI小鼠给药1-10mg/kg的3F7后与FXII敲除小鼠（FXII KO）结果相似（图二A和B）。在腹部动脉损伤实验中也获得了相似结果（图二C）。此外，对hF12KI小鼠尾部出血时间的监测表现正常，表明3F7介导的hF12KI小鼠抗血栓作用与止血功能受损无关（图二D）。综上所述，hF12KI小鼠表达的hF12蛋白质的体内功能正常，该小鼠模型可广泛用于基于FXII靶点开发的小分子抑制剂等药物的体内安全性和有效性评价。
图二 3F7在hF12KI小鼠中抑制FXII引起的血栓形成[5]
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参考文献
1. Nickel KF, Long AT, Fuchs TA, Butler LM, Renne T. Factor XII as a Therapeutic Target in Thromboembolic and Inflammatory Diseases. Arterioscl Throm Vas. 2017, 37(1):13-20.
2. Girolami A, Ruzzon E, Lombardi AM, Cabrio L, Randi ML. Thrombosis-free surgical procedures in severe (Homozygote) factor XII deficiency: Report of four additional cases and literature review. Clin Appl Thromb-Hem. 2004, 10(4):351-355.
3. Renne T, Pozgajova M, Gruner S, et al. Defective thrombus formation in mice lacking coagulation factor XII.J Exp Med. 2005, 202(2):271-281.
4. Kleinschnitz C, Stoll G, Bendszus M, et al. Targeting coagulation factor XII provides protection from pathological thrombosis in cerebral ischemia without interfering with hemostasis. J Exp Med. 2006, 203(3):513-518.
5. Beck S, Stegner D, Loroch S,et al. Generation of a humanized FXII knock in mouseotection from pathological thrombosis in ce‐thrombotic agents. J Thromb Haemost. 2021, 00:1-6.
6. Wallisch M, Lorentz CU, Lakshmanan HHS, et al. Antibody inhibition of contact factor XII reduces platelet deposition in a model of extracorporeal membrane oxygenator perfusion in nonhuman primates. Res Pract Thromb Haemost. 2020, 4(2):205-216.
7. Larsson M, Rayzman V, Nolte MW, et al. A Factor XIIa Inhibitory Antibody Provides Thromboprotection in Extracorporeal Circulation Without Increasing Bleeding Risk. Sci Transl Med. 2014, 6:222.