技术分享：血糖响应型益生菌的开发与评价

糖尿病是一种慢性进行性疾病，是由于胰岛素缺乏或抵抗导致的血糖水平长期升高[1]。未控制的高血糖可引发多种病理过程，进而导致代谢综合征、肾脏疾病和内分泌功能障碍等并发症[2]。除了运动和饮食调整等生活方式的改变外，2型糖尿病的治疗还有多种选择，热门方法是使用肠促胰岛素激素，特别是胰高血糖素样肽-1（GLP-1），它通过刺激胰岛素分泌和抑制胰高血糖素生成来改善血糖调节[3]。艾塞那肽、司美格鲁肽和利拉鲁肽，这些GLP-1类似物已获FDA批准用于治疗2型糖尿病，并在降低空腹血糖水平和促进体重减轻方面展现出疗效[4]。然而，长期使用高剂量GLP-1及其类似物可能引发多种不良反应[5]。因此，理论上这些肽类药物的精确按需给药可能最大限度地减少潜在的副作用。

细胞治疗疗法例如分化的β细胞和产生降糖药物的工程化细胞，已为糖尿病治疗带来了希望，但在敏感性、信号干扰和移植相关安全性方面仍面临挑战[6]。相比之下，使用工程化微生物作为活体药物来进行疾病诊断和原位递送药物受到越来越多的关注[7]。工程化微生物已被应用于检测病理生物标志物[8]，一个典型实例是利用葡萄糖感应pCpxP系统检测尿液和血清中葡萄糖的全细胞生物传感器[9]。与此同时，基于工程化益生菌的活体药物已被开发用于代谢调节，这些药物通常通过消耗饮食或肠道来源的有毒代谢物、或者分泌治疗性物质来实现功能[10]。与合成哺乳动物细胞相比，口服工程化益生菌具有明显优势，包括增强的安全性和便利性，以及对肠道微生物组的潜在调节作用[11]。

2026年9月，Nature期刊发表了一项研究，开发了一种工程化的口服递送葡萄糖感应与功能响应的益生菌活体药物GIFT，用于“感应与响应”糖尿病血糖控制。该研究开发了一种基于合成基因电路的葡萄糖传感器，整合了葡萄糖响应型转录调节因子HexR，并与合成启动子耦合。当携带该传感器的工程化益生菌经口服给药后，可暂时定植于肠道，并根据超过正常阈值的葡萄糖水平调控治疗性转基因的表达。GIFT介导的血糖控制可改善小鼠的血脂谱，并减轻糖尿病相关并发症。这种基于益生菌的活体药物能够根据实时血糖水平进行治疗性给药，实现实时动态调整血糖水平，为代谢治疗提供了一个无需移植、可编程且可口服递送的感知与响应平台[12]。

恶臭假单胞菌中葡萄糖代谢途径的基因表达受基于HexR操纵子的葡萄糖可利用性的调控，HexR是一种葡萄糖响应转录调控因子[13]。基于此机制，研究者在益生菌大肠杆菌Nissle 1917（EcN）中设计了一个葡萄糖激活的转录系统。将gap-1启动子（P_gap-1）中的回文结构HexR结合序列（HexO）整合到组成型启动子（P_tac）下游，构建了合成启动子P_HexR。在无葡萄糖条件下，组成型表达的HexR与P_HexR结合抑制基因转录；当细胞摄取葡萄糖后，葡萄糖经Entner-Doudoroff途径酶转化为2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸（KDPG），后者与HexR结合，触发HexR离开P_HexR，从而启动基因转录（图一a和b）。经优化，最佳的系统由RBS4与P_HexR4（4× HexO）组成，在20 mM葡萄糖条件下表现出48.8倍的sfGFP诱导，将此葡萄糖生物传感器命名为GIFT。在以sfGFP为报告基因的GIFT益生菌（GIFT_GFP）中，转录激活呈葡萄糖浓度和时间依赖性。葡萄糖浓度5 mM以下几乎无诱导，在10 mM以上时急剧增加（图一c和d）。在12小时内的交替葡萄糖循环中，GIFT_GFP表现出完全可逆的转录激活动力学（图一e）。

图一 益生菌葡萄糖传感器的设计与性能表征[12]

接着，评估小鼠体内葡萄糖诱导的GIFT介导基因表达。首先检测野生型小鼠中GIFT能否被激活。与给予组成型表达LuxCDABE的EcN益生菌（EcN-Lux）的小鼠相比，给予表达发光杆菌LuxCDABE的GIFT益生菌（GIFTLUX）的小鼠表现出显著较低的生物发光信号（图一f-i），表明在正常血糖条件下，GIFT在野生型小鼠中基本处于失活状态。为探究LuxCDABE的“开启-关闭-开启”式表达动态，腹腔注射葡萄糖以模拟糖尿病小鼠中常见的血糖波动。口服GIFT_LUX益生菌30分钟后，腹腔注射葡萄糖溶液（1 g/kg）以升高血糖，激活了LuxCDABE在小鼠体内表达，随着血糖水平下降，LuxCDABE表达也随之下降；而第二次葡萄糖注射重新激活了LuxCDABE表达，表明该系统能够动态响应血糖波动（图一j-l）。在口服GIFT_LUX的野生型小鼠中观察到了类似的“开启-关闭-开启”基因表达动力学（图一m-o），表明GIFT益生菌能够根据血糖水平的变化来调控蛋白质表达。探究经口给予野生型小鼠与瘦素受体缺陷型（db/db）小鼠的GIFT_LUX益生菌对LuxCDABE基因表达的影响（图一p）。结果显示，db/db小鼠体内可诱导LuxCDABE的表达，而野生型小鼠中则未观察到明显表达（图一q和r），表明在高血糖水平的糖尿病小鼠肠道中也可诱导GIFT介导的基因表达。

接下来，研究者探究GIFT在糖尿病小鼠血糖调控中的应用。构建了产生人GLP-1缩短变体[14]的GIFT益生菌（GIFT_GLP-1），db/db小鼠口服后12小时，血糖水平显著降低（图二a和b）。为验证这种血糖改善是否归因于高血糖触发的GLP-1表达，监测GIFT_GLP-1给药后每小时血糖和血清GLP-1水平（图二c）。结果显示，GLP-1表达由升高的血糖诱导，在给药后2至4小时达到峰值，随后随着血糖水平恢复正常而下降（图二d和e）。给药后2小时测定的血浆胰岛素水平与对照PBS组相比显著升高（图二f），且门静脉血中GLP-1浓度显著高于外周循环中测得的浓度（图二g），表明存在强烈的门静脉–体循环梯度，GIFT来源的GLP-1除了全身内分泌信号外，还可能参与局部肠道-门静脉感应和神经通路的调控。接着进行为期30天的实验。每日口服一次10⁹ CFU的GIFT_GLP-1，成功恢复了db/db小鼠的葡萄糖稳态，葡萄糖耐量（IGTT）和胰岛素耐量（ITT）测试均显示显著改善（图二h-m），糖化血红蛋白水平显著降低（图二n），肝糖原含量显著增加，附睾脂肪系数降低。以上数据表明，口服GIFT益生菌能够在2型糖尿病小鼠中实现感知与响应式的血糖控制。实验还证实了为期30天的GIFT_GLP-1处理可通过抑制食物摄入和增强全身脂质氧化作用来改善db/db小鼠的血脂谱，对糖尿病相关并发症具有保护作用。

图二 GIFT在db/db小鼠体内实现感知与响应式血糖调控[12]

理论上，GIFT益生菌应能感知肠道中的葡萄糖浓度，研究者评估了膳食葡萄糖对这些体内传感动态的影响。肥胖DIO小鼠口服GIFT_LUX益生菌后，分别给予对照PBS或高糖饮食如可乐和巧克力。高糖食物触发血糖快速升高和LuxCDABE表达的相应增加（图三a-c）。在db/db小鼠中也观察到类似的葡萄糖依赖性诱导（图三d-f），证实了该传感器能够有效感知并响应餐后血糖波动。为提高GLP-1的递送效率，对GIFT_GLP-1益生菌进行基因改造，使其表达一种GLP-1四共聚物，该单体通过肠激酶切割位点相连，从而被小肠上皮细胞释放的肠激酶激活。将GIFT_LUX或GIFT_GLP-1益生菌灌胃DIO小鼠和db/db小鼠。30分钟后喂食可乐或巧克力以诱导餐后血糖峰值升高。结果显示，与GIFT_LUX处理的对照组相比，GIFT_GLP-1处理的小鼠餐后1小时内血糖峰值显著降低（图三g-k），表明短暂的血糖升高激活GIFT_GLP-1产生GLP-1并缓解餐后高血糖。

图三 GIFT介导DIO小鼠与db/db小鼠的餐后血糖调控[12]

研究者进一步评价GIFT_GLP-1益生菌在多种糖尿病及肥胖症小鼠模型中的治疗潜力。首先检测接受限制性低碳水化合物饮食db/db小鼠的响应性。与标准饲料饮食相比，低碳水化合物饮食适度降低血糖水平并显著减轻体重（图四a-c）。每日口服GIFT_GLP-1益生菌可诱导GLP-1表达，增加胰岛素水平，降低血糖，进一步减轻体重（图四b-e）。此外，GIFT_GLP-1益生菌治疗小鼠表现出胰岛素抵抗的降低，脂肪量、血清甘油三酯和血清总胆固醇的减少（图四f-i）。为模拟人类2型糖尿病代谢特征的非遗传性2型糖尿病模型，研究者使用链脲佐菌素在DIO小鼠中诱导糖尿病（图四j）。每日口服GIFT_GLP-1益生菌持续30天，与PBS和GIFT_LUX对照组相比，GIFT_GLP-1处理小鼠通过增加GLP-1和胰岛素水平成功恢复了葡萄糖稳态（图四k-n），以及显著降低的体重、脂肪量、血清甘油三酯和总胆固醇水平（图四o-r）。以上数据支持GIFT_GLP-1益生菌在多种糖尿病模型中调节血糖水平的潜在应用价值。

图四 GIFT介导的糖尿病治疗在不同小鼠模型中的评价[12]

非人灵长类动物因与人类的基因组和系统发育相似性，被广泛认为是啮齿动物模型与人类临床试验之间的中间模型。最后，研究者在自发性2型糖尿病食蟹猴中评价了口服GIFT_GLP-1的安全性和有效性（图五a）。单次口服GIFT_GLP-1（2 × 10¹¹ CFU/ kg）可迅速升高血清GLP-1和血浆胰岛素水平（图五b-e），同时伴随血糖显著降低，持续长达3天（图五f）。一项为期五周的研究表明，每三天口服一次GIFT_GLP-1能有效恢复葡萄糖稳态（图五g和h），显著改善口服葡萄糖耐量（图五i和j），并显著缓解胰岛素抵抗（图五k）。通过标准血清生化指标评估2型糖尿病猴的肝脏和肾脏功能，处理前后的丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、白蛋白与球蛋白比值、血尿素氮或肌酐水平均无显著差异。全血细胞计数显示，治疗后未观察到白细胞或免疫细胞亚群的显著增加，提示给予GIFT_GLP-1治疗并未引发炎症或过敏反应。此外，整个治疗期间动物体重保持稳定（图五l）。以上数据表明，口服GIFT_GLP-1益生菌在糖尿病猴模型中耐受性良好。

图五 GIFT在2型糖尿病非人灵长类动物中的血糖调控[12]

综上所述，该研究开发了GIFT益生菌，将精确的生理葡萄糖感知能力与剂量依赖性、可逆的GLP-1分泌机制相结合。GIFT代表了一种可编程的益生菌活体药物，实现了基于葡萄糖浓度、按需调控的血糖控制。除了GLP-1之外，这一模块化平台还能快速适配递送其他降糖药物，理论上为葡萄糖感应与多样化治疗输出的结合提供了灵活性。当前正致力于开发临床适用型制剂，结合良好的生产规范生产、生物安全性和稳定性评价，以及明确将其归类为转基因微生物的监管分类，都将促进GIFT的临床转化。

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