技术分享：揭示协调线粒体运输方向的分子开关
膜结合细胞器是由驱动蛋白（kinesin）和细胞质动力蛋白（dynein）沿微管进行运输。在大多数细胞中，微管的负端锚定在靠近细胞中心的中心体上，正端则朝向细胞外周。多数细胞器表现为双向运输，既有驱动蛋白驱动的正端方向运动（顺行），又有动力蛋白驱动的负端方向运动（逆行）[1]。特定细胞器在细胞中的分布是由这两种马达蛋白的相对活性所决定。已知线粒体倾向于以驱动蛋白或动力蛋白的最大速度顺行或逆行。表明驱动蛋白和动力蛋白并非持续性的相互对抗，可能存在协调这两种马达结合和/或活性的机制。
线粒体是双向细胞器运输中研究最为透彻的实例。由驱动蛋白-1介导的线粒体运输支持了能量需求旺盛的细胞周边生理过程，如细胞的向外生长和突触活动[2]。而由动力蛋白介导的中心体方向运输则是受损线粒体更新所必需的[3]。TRAK是一种多功能马达衔接蛋白，能够招募驱动蛋白-1和动力蛋白，并通过外膜受体Miro在内的多个相互作用伙伴与线粒体结合[4, 5]。脊椎动物有两个TRAK基因TRAK1和TRAK2，均能同等有效地结合动力蛋白-动力蛋白激活蛋白（dynactin）复合物。然而，TRAK1对驱动蛋白的亲和力远高于TRAK2。在海马神经元中，TRAK1优先将货物运输至轴突，而TRAK2则主要驱动向树突的运输[6]。先前的细胞研究还发现，TRAK介导的运输可响应不同信号的调节，例如细胞周期状态、葡萄糖可用性、活性氧（ROS）以及ATP/AMP比值[7, 8]。然而，关于这两种TRAK之间的差异、及其如何在驱动蛋白与动力蛋白运输之间进行切换，以及这种切换如何受胞内信号影响，目前仍知之甚少。
2026年8月，Science期刊报道了一项研究，鉴定出线粒体衔接蛋白TRAK存在一个动力蛋白调节螺旋（DRH），介导了动力蛋白与驱动蛋白运输之间的切换。DRH充当连接线粒体与马达蛋白的“分子开关”。当DRH处于闭合状态时，阻止动力蛋白结合，并允许驱动蛋白与TRAK结合，促使线粒体向细胞周边方向运输；当DRH处于开放状态时，允许动力蛋白与TRAK结合，驱动线粒体向细胞中心运输。应激激活的激酶可对DRH进行磷酸化修饰，诱导了动力蛋白的激活和驱动蛋白的解离。该研究揭示了一种响应胞内信号来协调线粒体定向运输的分子机制，为理解细胞极性、应激反应及神经退行性疾病的病理机制提供了全新的思路[9]。
线粒体与肌动蛋白、微管及其他细胞器之间存在着复杂的相互作用，加上自身的裂变与融合动力学，使得在细胞内分离和研究基于微管的马达蛋白调控充满了挑战[10]。为模拟基于微管的线粒体运输，研究者利用一种工程化蛋白（I3-01），该蛋白可自组装成约25 nm的正十二面体纳米笼[11]，将I3-01与Miro1的胞质结构域融合，构建合成线粒体货物，以实现纳米笼与基于微管的线粒体运输机制相偶联，其中Miro1是TRAK的线粒体受体。为实现合成线粒体货物的可视化或免疫沉淀，分别将荧光标签和FLAG标签融合至I3-01（图一A和B）。
图一 基于微管运输的合成线粒体货物[9]
当在永生化视网膜色素上皮（RPE-1）细胞中表达时，携带超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）标记的合成线粒体货物均匀分布于整个细胞质中，表明内源性TRAK不足以支持其高效运输（图一C）。然而，共表达TRAK1或TRAK2可导致货物发生微管依赖性的重新定位（图一C和D）。共表达TRAK1-mScarlet导致货物在细胞周边区域积累（图一C和D），与驱动蛋白驱动的顺行运输一致。相比之下，共表达TRAK2-mScarlet导致货物主要积累在核周区域（图一C和D），与动力蛋白驱动的逆行运输一致。对于TRAK2，部分细胞同时表现出核周和周边的积累（图一C），表明存在双向运输，尽管周边积累在群体水平上无统计学显著性（图一D）。用与HaloTag偶联的光激活JF-646染料进行标记，合成货物显示出定向运输，其速率与体内驱动蛋白和动力蛋白介导的线粒体运输报道速率[12]相近（图一E和F）。与先前研究相一致，驱动蛋白在TRAK1货物中的富集程度约为TRAK2的20倍，而动力蛋白和dynactin的水平在两者中相当（图一G）。
TRAK通过保守的基序与动力蛋白相互作用，包括与动力蛋白轻中间链（LIC）相互作用的CC1-box，与动力蛋白激活蛋白（dynactin）结合的Spindly基序、以及在活性马达复合物中夹在动力蛋白和dynactin之间的长卷曲螺旋结构域（CC）。TRAK的CC也能直接结合驱动蛋白-1（图一A）。为了解析TRAK介导的动力蛋白激活所需条件，研究者分别突变了与动力蛋白LIC和dynactin相互作用的保守CC1-box和Spindly基序。对于TRAK2，两种突变体均降低了动力蛋白活性，并将货物运输从双向转变为以驱动蛋白驱动为主（图一H）。然而，尽管Spindly基序突变削弱了TRAK2与动力蛋白和dynactin的相互作用，但CC1-box突变体中这两种马达组分仍保持关联（图一I）。类似地，对于TRAK1，Spindly基序突变体消除了与动力蛋白-dynactin的结合，而CC1-box突变体则未受影响。以上结果表明，TRAK2能够在驱动蛋白和动力蛋白介导的运输之间进行切换；动力蛋白活性通常占主导地位，但当动力蛋白活性降低时，驱动蛋白会接管运输。相比之下，TRAK1是一种驱动蛋白转运体，携带的动力蛋白-dynactin处于无活性状态。TRAK衔接蛋白中的Spindly基序是动力蛋白-dynactin结合所必需的，而LIC与CC1-box的额外结合则是激活动力蛋白运动性所必需的。
为了更好地理解马达蛋白与TRAK的结合，研究者采用AlphaFold2进行结构预测。结果显示，驱动蛋白的C端卷曲螺旋结构域（CC4，氨基酸820-923）与TRAK卷曲螺旋的C端部分（氨基酸205-260）形成一个四螺旋束（图二A）。AlphaFold2还预测，TRAK N端的一个螺旋结构（氨基酸85-106）会折叠回来并与TRAK卷曲螺旋的CC1-box区域相互作用，形成一个四螺旋束（图二A）。这一相互作用很特别，它模拟了动力蛋白LIC与BICD2动力蛋白衔接蛋白的CC1-box区域在晶体结构中[13]形成的疏水界面（图二B）。为了验证N端螺旋是否参与马达蛋白调控，研究者构建了嵌合蛋白，将这些螺旋区域（氨基酸81-106）在TRAK1和TRAK2之间互换。结果显示，这些嵌合蛋白的运输方向由折回螺旋的来源（TRAK1或TRAK2）所决定，而非由亲本多肽的剩余主体决定（图二C和D）。尽管将TRAK2的螺旋区域替换为TRAK1序列后驱动蛋白活性大幅增加（图二D），但驱动蛋白的结合并未恢复至野生型TRAK1的水平。这一结果提示，折回螺旋主要影响动力蛋白活性，而非驱动蛋白。
图二 AlphaFold2预测TRAK与马达蛋白的相互作用[9]
为了研究TRAK的N端螺旋如何调节马达活性，研究者对两个关键疏水残基突变为丙氨酸，TRAK1为F95A和L92A，TRAK2为M95A和F92A。突变体使得TRAK1的货物积累从周边区域转变为核周区域（图二E），并在TRAK2中维持了核周积累（图二F），表明动力蛋白激活需要折回螺旋从“闭合”构象到“开放”构象的结构重排，从而允许动力蛋白LIC与CC1-box结合。鉴于其在调节动力蛋白活性中的作用，研究者将该区域命名为“动力蛋白调节螺旋”（DRH）。DRH突变体还降低了TRAK与驱动蛋白的结合（图二G），这提出了一个可能性：螺旋开放后动力蛋白的激活可能不利于驱动蛋白的结合。为了验证这一点，在DRH突变体TRAK中引入了额外的Spindly box突变，该突变可消除动力蛋白-dynactin的结合（图一I）。在TRAK2中，与DRH突变体相比，DRH-Spindly双突变体导致更多的驱动蛋白结合（图二H）和运输（图二I），这与动力蛋白-dynactin激活拮抗驱动蛋白结合的观点一致。在TRAK1中，DRH-Spindly双突变体对驱动蛋白运输的影响较弱，与单独的DRH突变体相比，驱动蛋白结合仅适度增加，且未能将驱动蛋白结合恢复至野生型TRAK1的水平（图二H）。以上结果表明，动力蛋白的激活需要折回螺旋从闭合构象重排为开放构象，从而允许动力蛋白LIC与CC1-box结合，激活动力蛋白并促进驱动蛋白的解离，且实验表明这种切换机制不涉及Miro1线粒体受体。
为进一步探索DRH是否受到生理性调控，研究者使用质谱技术鉴定了与合成货物共免疫沉淀的TRAK翻译后修饰位点。在TRAK2的翻译后修饰位点中，S84尤为突出，该保守残基紧邻DRH上游（图三A和B）。在TRAK1中，对应的T84残基未检测到磷酸化。为了研究S84磷酸化在TRAK2介导运输中的作用，构建了S84A突变体以阻断磷酸化，以及带负电荷的S84E突变体作为潜在的磷酸化模拟物。AlphaFold2建模显示，S84E替代降低了DRH闭合构象的预测置信度。在合成货物运输实验中，与野生型TRAK2和S84E突变体相比，TRAK2 S84A减少了向中心体的动力蛋白运输（图三C），结合了更多的驱动蛋白（图三D），尽管这一效应并未转化为周边积累的增加（图三C）。相比之下，TRAK1的T84E和T84A突变体均未显著改变货物定位，表明T84磷酸化并不调节TRAK1介导的运输。
图三 应激诱导的TRAK2磷酸化激活了动力蛋白[9]
S84周围的序列与应激激活的丝裂原活化蛋白（MAP）激酶c-Jun N端激酶1（JNK1）至JNK3及p38δ的保守识别基序相匹配[14]。通过RNAi分别耗竭这类激酶，来验证是否参与激活TRAK2介导的动力蛋白活性。在测试的几种应激激活的激酶中，JNK2耗竭导致中心体积累的减弱最为显著（图三E）。接下来测试氧化应激能否激活动力蛋白运动性。采用一种氧化应激诱导剂亚砷酸盐，可激活JNK和p38 MAP激酶（图三F），并导致TRAK2驱动的货物向核周聚集（图三G）。相比之下，TRAK2 S84A突变体在氧化应激下未显示动力蛋白运输的显著增加（图三G）。以上结果表明，氧化应激诱导了DRH磷酸化，进而激活动力蛋白的运输。
为探究TRAK介导的天然细胞器的马达调控，研究者在图案化纤连蛋白基质上培养的细胞中测量线粒体的定位[15]。这些细胞具有均匀的形状和极性，为定量周边定位与中心体定位提供了可重复的实验体系（图四A和B）。在TRAK1或TRAK2存在下合成货物的定位，分别用于定义这些极化细胞中的周边区域和中心体区域（图四B和C）。与合成货物类似，表达TRAK1使线粒体分布向周边偏移，而表达TRAK2则导致线粒体向中心体聚集（图四A和B）。相比之下，过氧化物酶体在TRAK1或TRAK2表达时分布未发生变化。进一步研究DRH对线粒体分布的影响。与合成货物类似，对于TRAK1，DRH开放突变体导致线粒体定位从周边变为中心体聚集（图四D），而对于TRAK2，该突变体仍维持了中心体聚集（图四E）。为了研究动力蛋白与驱动蛋白在线粒体运输中的竞争关系，使用DRH-Spindly双突变体来减少动力蛋白结合。与单独的DRH突变体相比，DRH-Spindly双突变体促进了TRAK2而非TRAK1的驱动蛋白线粒体运输优于动力蛋白（图四D和E）。为验证JNK2介导的信号是否在氧化应激条件下促进线粒体的中心体聚集，用亚砷酸盐处理对照和JNK2耗竭细胞。在对照细胞中，亚砷酸盐导致线粒体在周边区域减少并在中心体区域积累，而这种效应在JNK2耗竭细胞中减弱（图四F）。单独的JNK2耗竭对线粒体分布无显著影响（图四F）。以上数据表明，通过合成货物检测揭示的TRAK DRH协调微管马达运输的机制，同样调控着线粒体的分布。
图四 TRAK介导的动力蛋白调控线粒体的分布[9]
最后，研究者测试在脊椎动物TRAK中发现的DRH调控开关机制是否也存在于其他动力蛋白衔接蛋白。JIP3和JIP4是两种溶酶体衔接蛋白，既能结合动力蛋白也能结合驱动蛋白，并具有推定的自抑制螺旋[16]。利用合成货物实验，发现突变JIP3中阻止动力蛋白LIC结合的自抑制残基以及JIP4中的类似残基（图四G）会导致核周积累，表明动力蛋白被激活。JIP3和JIP4的自抑制螺旋之后均有一段保守的丝氨酸残基序列，据报道这些残基可被磷酸化。将这些丝氨酸残基突变为磷酸化模拟物谷氨酸可强烈激活JIP4介导的动力蛋白运输（图四H），但对JIP3无此效果。以上结果表明，与TRAK2类似，JIP4的动力蛋白运输可能受到一种激酶的调控，该激酶可对自抑制螺旋邻近的残基进行磷酸化。
综上所述，该研究利用细胞内的“合成线粒体货物运输实验”和AlphaFold2结构预测与突变分析，在线粒体接头蛋白TRAK上找到了一个关键的动力蛋白调节螺旋DRH，可充当连接线粒体与马达蛋白的“分子开关”，驱动线粒体运动的方向转换（图四I）。当DRH折叠闭合时，阻止了动力蛋白LIC的结合，并允许驱动蛋白结合TRAK的螺旋卷曲结构域，促进线粒体进行顺向运输（图四I右）。应激激活的激酶会磷酸化DRH，使DRH构象发生变化，处于开放状态，动力蛋白被激活，驱动蛋白被解离，线粒体转为逆向运输（图四I左）。这一螺旋序列的差异解释了为何两种几乎完全相同的TRAK异构体能以基本相反的方向来运输线粒体。该研究定义了DRH作为衔接蛋白通用马达切换开关的角色，可整合细胞状态的多种信号，将其转化为马达蛋白的激活和细胞器的重新分布，为神经退行性疾病等线粒体运输相关疾病提供了新的研究靶点。
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参考文献
1. Cason SE, Holzbaur ELF: Selective motor activation in organelle transport along axons. Nature reviews Molecular cell biology 2022, 23(11):699-714.
2. Zhao Y, Song E, Wang W, Hsieh CH, Wang X, Feng W, Wang X, Shen K: Metaxins are core components of mitochondrial transport adaptor complexes. Nature communications 2021, 12(1):83.
3. Mandal A, Wong HC, Pinter K, Mosqueda N, Beirl A, Lomash RM, Won S, Kindt KS, Drerup CM: Retrograde Mitochondrial Transport Is Essential for Organelle Distribution and Health in Zebrafish Neurons. J Neurosci 2021, 41(7):1371-1392.
4. Glater EE, Megeath LJ, Stowers RS, Schwarz TL: Axonal transport of mitochondria requires milton to recruit kinesin heavy chain and is light chain independent. The Journal of cell biology 2006, 173(4):545-557.
5. Mitchell L, Reda KE, Fatima H, Vasquez CE, Quintero-Carmona OA: The C-Terminal Regions of TRAK Proteins Contain MIRO-Independent Mitochondrial Localization Domains. Cytoskeleton (Hoboken, NJ) 2026, 83(4):187-199.
6. Loss O, Stephenson FA: Developmental changes in trak-mediated mitochondrial transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences 2017, 80:134-147.
7. Pekkurnaz G, Trinidad JC, Wang X, Kong D, Schwarz TL: Glucose regulates mitochondrial motility via Milton modification by O-GlcNAc transferase. Cell 2014, 158(1):54-68.
8. Debattisti V, Gerencser AA, Saotome M, Das S, Hajnóczky G: ROS Control Mitochondrial Motility through p38 and the Motor Adaptor Miro/Trak. Cell Rep 2017, 21(6):1667-1680.
9. Gladkova C, Paez-Segala MG, Grant WP, Kittisopikul M, Myers SA, Wang Y, Vale RD: A molecular switch for coordinating kinesin and dynein transport of mitochondrial cargo. Science 2026, 393(6811):601-606.
10. Misgeld T, Schwarz TL: Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron 2017, 96(3):651-666.
11. Hsia Y, Bale JB, Gonen S, Shi D, Sheffler W, Fong KK, Nattermann U, Xu C, Huang PS, Ravichandran R et al: Corrigendum: Design of a hyperstable 60-subunit protein icosahedron. Nature 2016, 540(7631):150.
12. MacAskill AF, Kittler JT: Control of mitochondrial transport and localization in neurons. Trends in cell biology 2010, 20(2):102-112.
13. Lee IG, Cason SE, Alqassim SS, Holzbaur ELF, Dominguez R: A tunable LIC1-adaptor interaction modulates dynein activity in a cargo-specific manner. Nature communications 2020, 11(1):5695.
14. Johnson JL, Yaron TM, Huntsman EM, Kerelsky A, Song J, Regev A, Lin T-Y, Liberatore K, Cizin DM, Cohen BM et al: An atlas of substrate specificities for the human serine/threonine kinome. Nature 2023, 613(7945):759-766.
15. Kanfer G, Courthéoux T, Peterka M, Meier S, Soste M, Melnik A, Reis K, Aspenström P, Peter M, Picotti P et al: Mitotic redistribution of the mitochondrial network by Miro and Cenp-F. Nature communications 2015, 6:8015.
16. Singh K, Lau CK, Manigrasso G, Gama JB, Gassmann R, Carter AP: Molecular mechanism of dynein-dynactin complex assembly by LIS1. Science 2024, 383(6690):eadk8544.
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