技术分享：病理tau结合Arc进入细胞外囊泡实现细胞间传播

神经退行性疾病的特征是特定脑区内的蛋白质聚集，并随着疾病进展扩散至全脑。tau蛋白的异常累积是阿尔茨海默病（AD）、额颞叶痴呆（FTD）和慢性创伤性脑病等的核心组织病理学标志，是由错误折叠的tau蛋白构成的细胞内神经原纤维缠结[1, 2]。在衰老过程中，tau蛋白发生过度磷酸化，导致其错误折叠并降低微管亲和力。病理性tau以细胞间传播的方式扩散，且扩散程度及水平与AD患者认知的下降程度密切相关[3]。在AD中，tau通过突触连接的神经环路传播，起始于蓝斑或内嗅皮层，最终扩散至海马和新皮质区域[4]。神经元活动调节tau从神经元中的释放，高神经元活动水平则加剧了tau病理。然而，这种活动依赖性tau释放和传播的机制尚不明确。Tau以游离蛋白形式或包裹在细胞外囊泡（EV）中被分泌[5]，健康神经元通过包括低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）介导的摄取等机制摄取胞外游离tau[6]，而EV-tau介导的内吞途径尚不明确。

神经元基因Arc是突触可塑性和记忆巩固的主要调控因子，与AD病理相关[7]。在疾病发病早期，AD患者以及包括突变tau转基因小鼠在内的AD小鼠模型中观察到与Arc蛋白水平升高相关的惊厥活动增加。Arc蛋白可自发形成病毒样衣壳，包封RNA，这一特性来自其逆转录转座子起源。Arc通过I-BAR蛋白IRSp53在神经元活动后从树突释放到EV中，而IRSp53最近也被发现与tau相互作用[8]。过度磷酸化的tau错误定位于树突及突触后组分，导致突触功能障碍[9]。综合这些数据提示，Arc可能在调控tau释放和传播中发挥重要作用。

2026年7月，Cell期刊报道一项研究，发现神经元基因Arc通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用，在细胞外囊泡（EV）释放tau蛋白的过程中起关键作用。衣壳形成蛋白Arc可与tau结合，并将其包装入神经元释放的EV中，这一过程既能清除胞内具有毒性的tau，又能促进tau在细胞间的传播。在阿尔茨海默病（AD）患者大脑中分离的脑源性EV中，Arc水平与磷酸化tau水平呈强正相关。Arc敲除小鼠在疾病早期表现出细胞内tau蛋白积累增加，并伴有细胞毒性增强，而tau蛋白的细胞间传播几乎完全缺失。该研究重新定义了Arc蛋白在AD中的角色，首次明确Arc可将具有传播能力的tau包装进神经元释放的EV中，为tau的跨神经元传播提供了一个具体的、可干预的分子靶点[10]。

首先，研究者探究Arc是否促进神经元EV中tau的释放。采用野生型（WT）和Arc敲除（KO）的大鼠原代皮层神经元[11]，在体外培养第10天慢病毒转导表达P301L突变hTau（hSyn-eGFP-2A-2N4R-hTau），在第17天收集细胞裂解液和培养基。通过尺寸排阻色谱（SEC）分离EV，使用hTau特异性ELISA定量检测裂解液和EV中的hTau水平。结果显示，WT和Arc KO细胞裂解液中的总hTau水平相当，而Arc KO原代神经元中EV-hTau的释放显著减少（图一A）。Arc EV的生物发生和释放由I-BAR蛋白IRSp53所介导，而IRSp53也与tau相互作用。为了探究IRSp53的作用，研究者在Neuro2a细胞中单独或共转染P301L-hTau、Arc和IRSp53，发现仅当Arc和IRSp53共同表达时，EV-hTau释放才显著增强，且释放的Arc比例更高（图一B）。以上结果表明，Arc通过IRSp53介导途径促进EV包装hTau，进而EV-hTau从神经元中释放。

图一 Arc介导神经元EV中hTau的释放[10]

为验证Arc是否在体内调控tau的释放，研究者采用超速离心结合SEC从4月龄rTg^WT小鼠脑组织中分离EV，这些小鼠在前脑兴奋性神经元中表达转基因P301L hTau，在钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）启动子驱动下形成tau聚集体。结果显示，在脑源性EV中可检测到hTau，包括全长和磷酸化形式的hTau（图一C），以及Arc、hTau和syntenin在无去垢剂时可抵抗蛋白酶K的降解（图一D），表明它们位于EV腔内。为了确定Arc是否促进脑EV中hTau的释放，研究者将rTg^WT小鼠与Arc KO小鼠杂交获得rTg^{Arc KO}小鼠，使用Western blot、ELISA检测EV中hTau水平。结果显示rTg^{Arc KO}小鼠的EV中hTau水平显著降低（图一E和F）。然而，纳米颗粒示踪分析结果显示，rTg^WT与rTg^{Arc KO}小鼠的整体脑EV产量相当（图一G），表明体内Arc缺失并不影响脑EV的生成总量。

进一步评估hTau和Arc是否共同包装在脑源性EV中。免疫金电镜观察发现脑EV中部分仅含Arc、部分仅含hTau，或两者兼有（图一H）。当使用6 nm金颗粒标记Arc或hTau时，约12%的EV对每种蛋白呈阳性（图一G）。相反，当使用6 nm金颗粒标记Arc、15 nm金颗粒标记hTau进行双免疫金标记时，约3.5%的EV呈双阳性（图一H）。然而，较大的15 nm金颗粒仅能标记约4%的EV含hTau，可能由于较大的15 nm金颗粒穿透EV膜的能力较差，而去垢剂产生的孔径可能小于15 nm[12]，因此Arc-hTau共阳性EV的真实情况可能被低估。以上结果表明，部分EV同时含有Arc和hTau，在体内Arc对于tau包装入脑EV中至关重要。

神经元摄取细胞外错误折叠的tau后，可能导致自身正常生理性tau发生错误构象并聚集，而这些异常聚集的tau蛋白甚至能够像“种子”一样，在神经元之间传播[13]。AD患者来源的EV已被证实具有这种播种能力[5]。为确定EV-hTau的传播能力，研究者在HEK293 tau生物传感器细胞中进行基于荧光共振能量转移（FRET）的tau播种实验[14]，该细胞稳定表达hTau(P301S)^RD-CFP/YFP。hTau P301S重复结构域（RD）仅在具有播种能力的hTau存在时发生聚集，产生FRET信号（图二A）。为确定脑EV的传播能力，研究者将4月龄rTg^WT或rTg^{Arc KO}小鼠的脑EV转染进生物传感器细胞，通过流式细胞术检测FRET阳性细胞比例和密度。结果显示，rTg^WT脑源性EV能显著诱导出FRET阳性细胞以及较高的FRET密度，而rTg^{Arc KO}脑源性EV诱导的FRET阳性细胞极少，FRET密度显著降低，表明其hTau传播能力大大减弱（图二A和B）。以上结果表明，脑源性EV中的hTau能够播种tau聚集体，而Arc参与了具有播种能力EV-hTau的包装。

图二 脑源性EV中的hTau能够播种tau聚集体[10]

rTg^WT小鼠脑源性EV含有Arc和hTau，且该小鼠品系中突变型hTau高度过表达。为了确定人脑源性EV是否也含有Arc和hTau，研究者获取了6例年龄匹配的非AD对照者和6例Braak六级AD患者的死后速冻前额叶皮层组织，分离EV。结果显示，所分离EV呈现典型的EV形态（图三A），粒径小于200 nm（图三B），对照者与AD患者的脑EV在整体形态和大小上未见可检测的差异（图三A和B）。非AD与AD组间，脑EV中syntenin、Arc、总hTau及磷酸化hTau水平均无统计学显著差异（图三C），但在AD脑匀浆中观察到总磷酸化hTau水平升高。EV中Arc与磷酸化hTau水平呈正相关，且在非AD和AD的脑EV中，Arc水平高的对应磷酸化hTau水平也高（图三C和D）。AD脑EV中存在着Arc-hTau双标记的EV，仅含Arc、仅含hTau和Arc-hTau共阳性的EV分别约占10%、15%和4%，与小鼠脑源性EV的发现一致（图一E）。以上结果表明，在人脑中Arc和hTau可共同包装入EV，且Arc驱动磷酸化hTau在EV中的释放。

图三 人脑源性EV含有Arc和磷酸化tau[10]

鉴于Arc依赖性EV-hTau释放的特异性，研究者假设Arc通过直接的蛋白质相互作用将hTau包装入EV。从大肠杆菌中纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）、GST-Arc和GST-Endophilin，固定于磁珠后，随后与未转染细胞（UT）或转染WT或P301L hTau的HEK293T细胞裂解液孵育，进行体外结合实验。结果显示，WT和P301L hTau均能结合纯化的Arc蛋白，但不结合GST或GST-Endophilin（图四A）。还观察到纯化的重组突变型hTau蛋白能结合纯化的Arc蛋白（图四B），表明二者存在特异性的直接相互作用。由于Arc EV释放由IRSp53所介导，研究者还检测了Arc、hTau和IRSp53是否在体内相互作用。为诱导Arc表达，将4月龄rTg^WT小鼠置于丰富刺激环境中6小时，小鼠皮层裂解液免疫共沉淀实验结果显示，hTau和IRSp53均与Arc共沉淀（图四C），表明在活体小鼠脑中Arc、hTau和IRSp53存在相互作用。为确定人脑中Arc、hTau和IRSp53是否也存在相互作用，研究者从非AD对照者、Braak二级AD患者和Braak六级AD患者的死后大脑前额叶皮层组织中免疫沉淀hTau。结果显示，在对照者和AD患者脑中，Arc和IRSp53均与hTau共沉淀（图四D）。为检测hTau磷酸化是否影响Arc-hTau结合，将GST-Arc与SF9细胞来源的磷酸化hTau或经磷酸酶处理的去磷酸化hTau孵育，结果发现Arc与磷酸化hTau的结合亲和力显著高于非磷酸化hTau（图四E）。以上结果表明，Arc对磷酸化hTau具有更高亲和力，Arc通过与hTau直接结合，与IRSp53形成三元复合物。

图四 Arc、IRSp53与hTau在小鼠和人脑皮层中直接相互作用[10]

比较rTg^WT与rTg^{Arc KO}同窝小鼠的脑组织，评估背侧海马CA1区的总hTau水平，发现与rTg^WT小鼠相比，rTg^{Arc KO}小鼠单个神经元和树突中的细胞内hTau水平显著增加（图五A和C），且CA1细胞体层的神经元数量减少（图五B和D）。为评估细胞内hTau积累是否与神经元毒性相关，研究者比较了4月龄rTg^WT与rTg^{Arc KO}小鼠背侧CA1区的TUNEL染色，结果发现rTg^{Arc KO}小鼠TUNEL阳性染色面积显著增加，提示该区域细胞死亡显著增加（图五E-G）。为确定rTg^{Arc KO}小鼠在更晚年龄时是否加速tau病理，检查8月龄rTg^WT与rTg^{Arc KO}小鼠的hTau表达和细胞死亡，发现4月龄和8月龄两种基因型间均无显著差异。以上结果表明，在疾病进展早期，Arc缺失导致神经元内hTau积累，但并不会在发病后期显著加速tau病理。

图五 rTg^{Arc KO}小鼠神经元的细胞内hTau积累，加剧细胞死亡[10]

Tau的细胞间传播依赖于EV释放和摄取效率[15]。为了确定Arc是否在hTau从供体神经元向受体神经元的细胞间传播中起关键作用，研究者进行hTau传播实验。在体外培育原代海马神经元，并稀疏转导AAV-hSyn-eGFP-2A-2N4R hTau(P301L)。该构建体可从单条mRNA产生等摩尔比例的eGFP和hTau蛋白，2A肽序列在翻译过程中自剪切，将eGFP和hTau分离为独立蛋白（图六A）。eGFP与hTau的免疫荧光可区分出，通过细胞间传播接收hTau的神经元只表达hTau而不表达GFP（图六A）。该构建体稀疏转导WT和Arc KO原代海马神经元，7天后发现两种基因型中均只能观察到GFP/hTau双阳性神经元，未见hTau转移，而转导14天后发现WT和Arc KO中供体神经元（GFP⁺, hTau⁺）比例相同，但Arc KO神经元中hTau受体神经元（GFP^-, hTau⁺）的比例显著减少（图六B-D）。为检测Arc是否在体内hTau细胞间传播中发挥作用，研究者将hSyn-eGFP-2A-2N4R hTau(P301L)注射至6月龄WT和Arc KO小鼠的内侧内嗅皮层（图六E）进行稀疏标记，10周后收集大脑并对注射部位对侧内嗅皮层连续切片进行成像（图六F）。结果显示，两组小鼠注射部位对侧内嗅皮层中供体神经元数量相当（图六G和H），但Arc KO小鼠中hTau受体神经元显著减少（图六G和I）。以上结果表明，Arc对hTau的神经元间传播至关重要。

图六 Arc对hTau的细胞间传播至关重要[10]

综上所述，该研究描述了Arc可通过蛋白质-蛋白质直接相互作用，将hTau包装入细胞外囊泡（EV）中的特定分子作用。具体而言，Tau蛋白发生过度磷酸化，并错误定位至突触后组分。在阿尔茨海默病（AD）早期，由于神经元过度兴奋，Arc水平升高，tau、Arc和IRSp53相互作用，促进Arc衣壳形成及EV生成。Tau被包装入EV中，并响应神经元活动而释放，进而被邻近神经元摄取后，递送的病理性tau在胞内引发tau聚集的播种效应。Arc缺失后，由于缺乏EV介导的tau释放，病理性tau在神经元内蓄积，导致细胞毒性并加剧细胞死亡，同时tau病理的整体扩散减少（图七）。该研究阐明了Arc作为tau EV包装和传播的关键调控因子及其分子机制，为tau蛋白相关疾病治疗提供了信息。在携带病理性tau的细胞外囊泡从病变神经元中释放出来，但尚未传播到健康神经元的这一路径进行阻断，将是一种有前景的治疗策略。

图七 Arc通过蛋白质-蛋白质相互作用将hTau包装入EV中[10]

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