技术分享：线粒体与核孔复合体直接互作传递能量
线粒体是产生ATP的细胞器，可通过与其他细胞器的直接或间接相互作用来调控细胞过程，参与了广泛的细胞功能。例如在线粒体-内质网接触位点的磷脂交换[1]、钙离子转移或活性氧生成[2]。线粒体是动态且可移动的细胞器，能够根据细胞对ATP的空间需求来改变自身的细胞定位。线粒体与细胞核之间的长距离通讯已被广泛研究，但关于这两种细胞器之间紧密相互作用的报道却很少。在癌细胞中，线粒体与细胞核之间存在膜相互作用，促进了促存活信号从线粒体向细胞核的转运[3]。线粒体还可以通过丝裂融合蛋白2位点与核膜相互作用，促进丙酮酸脱氢酶复合物进入细胞核，从而协助了组蛋白的乙酰化[4]。
核孔复合物（NPC）是一个由30多种不同蛋白质相互作用形成的大型蛋白质复合体，负责调控RNA和蛋白质在细胞核与细胞质之间的主动运输[5]。在细胞质侧，NPC呈现出伸向细胞质中的丝状结构，其中RANBP2（也称为NUP358）是构成这些细胞质丝的主要成分。RANBP2包含多个功能结构域，影响着多种生物学过程，如有丝分裂过程中的纺锤体形成和染色体分离、以及蛋白质的稳态调控[6]。尽管线粒体与核膜之间的相互作用已被认为与核内能量稳态调控及组蛋白修饰有关，但高能磷酸分子如何穿越不可渗透的核膜仍然不清楚。
2026年6月，Nature期刊报道了一项研究，发现线粒体与核孔复合物之间存在直接相互作用。这种物理相互作用由线粒体外膜蛋白VDAC1和核孔丝状蛋白RANBP2的C端结构域所介导。在体外实验中，CRISPR敲除RANBP2、截短RANBP2的C端结构域或对RANBP2-VDAC1相互作用的氨基酸进行定点突变，均会导致线粒体与细胞核的距离增加、细胞核内ATP和磷酸肌酸水平的下降。同时，核内磷酸化蛋白质组水平降低，组蛋白修饰、细胞分化及转录调控等相关通路也出现下调。此外，在小鼠体内敲除RANBP2的C端结构域会出现心脏和神经嵴分化缺陷，导致胚胎致死。该研究揭示了一种全新的线粒体与核孔复合物直接相互作用的机制，有助于理解细胞能量供应、细胞分化以及胚胎发育等生理过程[7]。
首先，研究者表征线粒体与细胞核之间的相互作用。共聚焦和超分辨显微镜观察显示，在10T1/2细胞和心脏组织中，均有一部分线粒体与核外膜（ONM）蛋白SYNE3/SYNE1相关联（图一a和b）。心脏、大脑和10T1/2细胞的透射电子显微镜观察证实了这种接触，发现线粒体通过电子密度较高的丝状结构与核孔复合物（NPC）相连（图一c）。在10T1/2细胞中分别对NPC蛋白NUP107（图一d）或核孔丝状蛋白RANBP2（图一e）进行染色，并用MitoTracker标记线粒体，也观察到线粒体与NPC的这一物理接触。由于在心肌细胞中观察到了线粒体与NPC的接触（图一b和c），为探究这种接触是否会随着出生后心脏的成熟而发生改变，研究者分析了从出生后第1天（P1）到成年期的心脏组织。透射电镜定量分析显示，在整个心脏发育过程中，与NPC接触的线粒体所占比例及其与NPC的距离保持稳定，仅在P7和P14的出现频率略微增加（图一f-i）。进一步比较不同组织，探究线粒体与NPC的接触在不同器官间是否存在差异。对成年心脏、大脑和小肠的对比分析，证实了这一特征具有普遍性（图一j-m）。尽管小肠上皮细胞的线粒体-NPC距离略为增大，但在心肌细胞和神经元的分布更为紧密（图一m）。以上数据表明，在各种组织内线粒体与NPC之间存在一种普遍的、物理性相互作用。
图一 线粒体与细胞核的相互作用[7]
为探究线粒体与NPC之间的相互作用分子，研究者在纯化线粒体中进行蛋白质组学实验，以寻找互作的NPC蛋白。从L929细胞中分离出完整的线粒体，通过蓝色非变性电泳结合质谱蛋白质组学技术分析其组分。在所有分析样本中均检测到了NPC蛋白。除核篮蛋白外，核孔复合体的多数亚复合体蛋白质均被检出。其中，最外层结构的核孔丝状蛋白含量最为丰富（图二a）。采用同样的方法，在缺失电子传递链复合物I、III或IV的线粒体中检测到NPC蛋白的肽段数量有所减少，尤其是核孔细胞质丝的主要成分RANBP2。研究者推测RANBP2的C端结构域（CTD）可能介导了线粒体与NPC的对接，RANBP2-CTD是脊椎动物特有的，且高度保守。于是，表达了带有GST标签的CTD，并通过圆二色谱确认了其正确折叠状态（图二b）。使用纯化的心肌线粒体进行GST-CTD下拉实验，得到了一条特异性的40 kDa条带，质谱分析显示富集了线粒体外膜蛋白及内膜成分。其中，VDAC1是富集丰度最高的线粒体外膜蛋白。此外，采用另一种BiolD蛋白质组学技术，通过将BirA酶与RANBP2-CTD融合。在CTD-BirA特异性标记的98种蛋白质中，包括了24种线粒体相关蛋白。其中，VDAC1是唯一仅定位于线粒体外膜的蛋白。以上数据表明，GST和BioID两种筛选方法均鉴定出VDAC1是与RANBP2-CTD发生相互作用的主要线粒体候选分子。
图二 线粒体-细胞核相互作用的蛋白质组学分析[7]
进一步对RANBP2与VDAC1的潜在相互作用进行解析。研究者在10T1/2细胞和心脏组织中进行RANBP2与VDAC1共染色，发现VDAC1存在于RANBP2的定位区域，即接触位点（图二c）。使用RANBP2和VDAC1的抗体在10T1/2细胞中进行邻近连接分析（PLA），可在对照细胞的核表面检测到PLA信号，而在Ranbp2基因敲除（RKO）细胞系中PLA信号几乎消失（图二d）。尽管另一个线粒体外膜蛋白VDAC3在10T1/2细胞中的丰度与VDAC1相当（图二e），但在CTD-BirA实验中只有VDAC1被生物素标记，提示这一结合具有明确的亚型特异性，这可能归因于VDAC1与VDAC3之间的序列差异（图二f）。
为了理解结合的分子基础，研究者采用AlphaFold预测RANBP2-CTD和VDAC1的相互作用，推测RANBP2可能通过F2977-D2978与VDAC1的E50-T51-T52残基发生相互作用（图二g）。值得注意的是，这种相互作用不会堵塞VDAC1孔道，形成了一个直径约为10 Å的通道，可能有助于代谢物如磷酸肌酸（直径6.8-8.2 Å）和ATP从线粒体直接转运至NPC（图二g）。为了验证这些残基的作用，研究者构建了VDAC1 ETT>ILL和CTD FD>AA的突变结合预测。这些突变改变了CTD的位置，减少了两者相互作用的表面积，破坏了复合物的结构，但不改变单个蛋白质的整体三维折叠状态（图二h）。研究者在敲除VDAC1的人诱导多能干细胞（hiPSC）中进行验证，使用T2A共表达了野生型或突变型的VDAC1和FLAG-CTD。免疫共沉淀结果显示，野生型VDAC1能与CTD发生相互作用，而ETT突变或FD突变均削弱了这一相互作用（图二i）。此外，VDAC1的ETT基序在人类和小鼠中高度保守，但在VDAC3中不存在（图二f）。以上数据表明，VDAC1的ETT基序和RANBP2-CTD的FD残基是有效形成线粒体-NPC连接所必需的。
为研究RANBP2在建立线粒体-NPC接触点中的作用，研究者利用CRISPR-Cas9构建了Ranbp2敲除（RKO）细胞系。定量PCR和蛋白质印迹结果显示，RANBP2在mRNA水平和蛋白水平上均被有效敲除；与核外膜标志物SYNE3免疫染色相比，核膜上的RANBP2染色信号在KO后消失（图三a）。使用接触位点评分（CSS）来定量分析线粒体-细胞核的接触，定义为：与MitoTracker表面距离为零的核外膜SYNE3点状信号数量，除以总SYNE3点状信号数量和总线粒体表面积（图三b和c）。RKO细胞中接触位点评分显著降低（图三b和c）。类似地，Vdac1敲除细胞也表现出接触位点的相应减少，表明RANBP2-VDAC1的相互作用是线粒体锚定在核孔的关键。
图三 体外敲除Ranbp2对线粒体-NPC接触的影响[7]
接着，研究者探究这一接触是否影响细胞核内的能量水平。使用染色质靶向的ATP FRET传感器ATeam-H2AX[8]，观察到RKO细胞中核内ATP水平显著低于野生型细胞（图三d和e）。为进一步解释这一现象，研究者建立了反应-扩散生物物理模型，用于预测NPC处的ATP浓度与线粒体距离之间的关系。该模型预测，当线粒体与NPC的距离从50 nm（锚定状态）增加到500 nm（非锚定状态）时，核孔附近ATP浓度将下降约90%，凸显了线粒体与NPC近距离接触的有效性（图三f和g）。然而，ATP并不是细胞核内唯一的高能分子，细胞还拥有其他富含能量的分子以及磷酸基团转移系统，以确保在需要的位置能够获得ATP。最丰富的能量转移分子之一是磷酸肌酸，可在线粒体中由ATP和肌酸合成，并在其作用部位被水解以产生ATP。因此，研究者通过抗体染色、图像分割和荧光定量分析检测细胞培养的不同阶段，在基线测量后24小时和48小时的磷酸肌酸含量（图三h）。结果显示，在所有时间点，RKO细胞核内的磷酸肌酸均显著减少，而胞质中的磷酸肌酸则随时间累积（图三h和i），提示核内磷酸肌酸的转运受损。RKO细胞核内磷酸肌酸的缺乏与细胞周期无关（图三j和k）。为了证实细胞核能够利用磷酸肌酸，在10T1/2细胞中鉴定出了线粒体肌酸激酶CKMT1/2和核型肌酸激酶CKB的表达（图三l），这支持了磷酸肌酸由线粒体生成、在细胞核内被水解的模型。
进而，研究者探究RKO细胞系中核内能量降低所导致的下游缺陷。细胞核需要大量能量来维持DNA合成、修复、转录和染色质修饰等过程。其中许多过程，尤其是DNA复制和修复，是通过磷酸化这一个高度依赖ATP的过程来调控的。磷酸化蛋白质组学分析显示，RKO细胞核内的整体磷酸化水平显著降低，而非核肽段的磷酸化水平则未检测到变化（图四a）。这种下降并非由于激酶丰度降低所致，因为核蛋白质组学分析显示，野生型与RKO细胞之间的激酶水平并无显著差异（图四a）。为了在功能上验证这一观察结果，使用EGF刺激野生型和RKO细胞5分钟。已知EGF可通过PKA激酶诱导细胞核内CREB蛋白的磷酸化（pCREB）。在RKO细胞中，pCREB水平显著降低（图四b）。RNA测序分析共鉴定出5,934个差异表达基因，其中下调基因显著富集在蛋白质磷酸化、转录和分化相关过程。进一步研究表观遗传，重点关注抑制性组蛋白标志物H3K27me3。ChIP-seq分析显示，H3K27me3在RKO细胞启动子区域的水平总体降低（图四c）。由于组蛋白甲基化并非ATP依赖性过程，可能是种间接效应。相比之下，染色质的开放程度受ATP依赖的核小体重新定位的调控。ATAC-seq分析显示，RKO细胞中启动子区域的染色质可及性峰值显著减少（图四d），表明核内ATP和磷酸肌酸水平的降低直接损害了核小体动力学。RNA-seq的表达下调基因、H3K27me3水平增加的区域、以及ATAC-seq信号降低的区域，一致性的富集在发育相关过程（图四e）。
图四 RKO细胞的转录组学与蛋白质组学分析[7]
为从功能上展示上述分化缺陷，使用5-氮杂胞苷诱导10T1/2细胞分化为肌管细胞和脂肪细胞。RKO细胞显示出分化细胞数量的急剧减少，且成熟谱系标志物的显著下调（图四f-h），表明了线粒体-NPC接触缺失后体外分化能力受损。为探究VDAC1的点突变或RANBP2 CTD的缺失能否在hiPSC中重现RKO细胞表型，构建了两种CRISPR编辑的hiPSC：一种携带VDAC1 ETT>LII突变，另一种则缺失RANBP2-CTD。这些修饰并未损害蛋白质的完整性。VDAC1突变不影响其线粒体定位。对于RANBP2-CTD截短的细胞系，分析了不依赖CTD的功能，包括mRNA转运、SUMO化作用和染色体分离，均未受影响。在验证了这些模型之后，观察到无论是CTD截短还是VDAC1突变的hiPSC，其核内磷酸肌酸含量均显著降低（图四i和k）。当诱导心肌细胞分化时，这两个细胞系在早期（第4天）和晚期（第6天）分化标志物的表达均显著降低（图四j和l）。以上数据表明，VDAC1与RANBP2-CTD之间的特异性相互作用对于细胞核获得适当的能量供应、以及后续的分化过程至关重要。线粒体产生的ATP和磷酸肌酸可通过VDAC1与RANBP2-CTD的连接结构递送至细胞核。核内肌酸激酶的存在使得这部分能量能够在局部被利用，驱动磷酸化反应、转录和染色质动力学等过程，从而直接影响细胞生长和分化。
最后，研究者探究线粒体-NPC接触丧失的体内影响。通过CRISPR-Cas9敲除RANBP2-CTD，构建了RANBP2ΔCTD小鼠模型（图五a）。发现纯合截短导致胚胎致死；在胚胎E10.5天时，纯合敲除胚胎仍符合孟德尔比例，但到E14.5天时已无法检测到纯合敲除胚胎（图五b）。在E10.5天，敲除胚胎的体积显著小于同窝野生型胚胎（图五c）。敲除胚胎中线粒体外膜与NPC之间的距离显著增加，且这种变化特异性地发生在NPC处，而并未影响总体的线粒体-核膜接近程度（图五d和e）。胚胎E10.5天的组织学分析显示，敲除胚胎的两个心室的心室壁均显著变薄（图五f和g），还观察到头部区域存在明显的神经管闭合缺陷（图五h），尽管胸段脊髓的厚度较为正常（图五i）。
图五 体内敲除Ranbp2-CTD对胚胎发育的影响[7]
为检测心脏和神经管中的增殖和分化是否受到影响，使用有丝分裂标志物pH3进行染色，定量分析显示敲除胚胎致密心肌中pH3阳性细胞显著增加（图五j和k），同时心肌总面积减少（图五l）。为了确定这是否源于细胞周期动力学的改变，进行EdU和BrdU双脉冲标记实验。尽管pH3阳性细胞增多，且掺入BrdU或EdU的心肌细胞数量也增加，但不同基因型之间的S期时长Ts和总细胞周期时长Tc没有显著差异（图五m和n）。然而，这些过度增殖的心肌细胞体积显著减小，在比较增殖与尺寸比率时，E10.5的敲除心脏与E9.5野生型心脏极为相似，表明心脏表型是由发育延迟所驱动的。在此情况下，细胞会像早期阶段的前体细胞那样持续进行分裂，而非逐渐成熟并增大体积。
研究者还检测了神经管中的细胞增殖和神经元分化（Tuj1，图五o）。尽管不同基因型之间pH3阳性的细胞数量没有差异（图五p），但敲除胚胎的Tuj1阳性区域显著减小（图五q），表明分化受损。神经管中的EdU-BrdU双标记实验显示，敲除胚胎中核苷酸类似物的掺入显著增加（图五r和s）。虽然S期时长Ts保持不变，但敲除胚胎的总细胞周期时长Tc显著缩短，约为7.5小时，而野生型约为11小时（图五s）。在神经发育过程中，较短的细胞周期是原始祖细胞扩增的标志，而细胞周期延长（尤其是G1期）则对分化为神经元必不可少。因此，敲除胚胎出现的缩短Tc与未能退出祖细胞状态、以及由此导致的发育延迟之间存在关联性。以上数据表明，由于RANBP2-CTD缺失导致的线粒体-NPC连接缺陷，使得敲除胚胎在心脏和中枢神经系统中均维持了一种原始的、快速增殖周期的发育状态，导致了发育延迟和胚胎致死。
综上所述，该研究报道了线粒体与核孔复合物（NPC）之间存在一种此前未知的物理相互作用，由线粒体外膜蛋白VDAC1和核孔丝状蛋白RANBP2的C端结构域所介导。这种物理连接直接调控细胞核的能量代谢，可将线粒体的ATP和磷酸肌酸直接通过核孔输送到细胞核，从而为细胞分裂和分化提供能量，对胚胎发育及心肌细胞分化具有关键作用。破坏连接会导致染色质结构改变、体外细胞分化受损、以及体内胚胎致死等表型（图六[9]）。该研究揭示了线粒体-细胞核通讯的复杂性，重新定义了对细胞能量供应的理解，这一线粒体-细胞核接触可直接为核内高耗能过程提供局部的代谢支持，以维持核内能量稳态，保障了转录调控、细胞命运决定、细胞分化等生理活动的有序进行。
图六 线粒体-细胞核接触为胚胎发育细胞分化提供能量[9]
GTP研发中心负责实施基因组标签计划（Genome tagging project, GTP），基于自主知识产权的类精子干细胞介导半克隆技术，为全基因组的功能基因一一贴上标签，致力于构建标签细胞和标签小鼠资源库。类精子干细胞是从精子来源单倍体囊胚中建系获得的一种孤雄单倍体胚胎干细胞，将其注入卵母细胞，能够像精子一样支持整个胚胎发育过程，产生健康的半克隆小鼠。GTP研发中心在类精子干细胞的蛋白质编码基因上原位敲入标签序列，建立了液氮保存的标签细胞资源库。研究需要时，利用半克隆技术将标签细胞注射到小鼠卵母细胞中，一步法获得标签小鼠。
已有标签产品可直接订购，详情查阅以下官网链接。如有需要欢迎联系，我们将竭诚为您服务。
标签细胞网址：
标签小鼠网址：
http://www.sibcb.ac.cn/gtp/msearch.jsp
地址：上海市岳阳路320号
责任编辑：甜点
新媒体运营：suway
参考文献
1. Vance JE: Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J Biol Chem 1990, 265(13):7248-7256.
2. Booth DM, Enyedi B, Geiszt M, Várnai P, Hajnóczky G: Redox Nanodomains Are Induced by and Control Calcium Signaling at the ER-Mitochondrial Interface. Mol Cell 2016, 63(2):240-248.
3. Desai R, East DA, Hardy L, Faccenda D, Rigon M, Crosby J, Alvarez MS, Singh A, Mainenti M, Hussey LK et al: Mitochondria form contact sites with the nucleus to couple prosurvival retrograde response. Sci Adv 2020, 6(51):eabc9955.
4. Zervopoulos SD, Boukouris AE, Saleme B, Haromy A, Tejay S, Sutendra G, Michelakis ED: MFN2-driven mitochondria-to-nucleus tethering allows a non-canonical nuclear entry pathway of the mitochondrial pyruvate dehydrogenase complex. Mol Cell 2022, 82(5):1066-1077.e1067.
5. Wente SR, Rout MP: The nuclear pore complex and nuclear transport. Cold Spring Harbor perspectives in biology 2010, 2(10):a000562.
6. Joseph J, Liu ST, Jablonski SA, Yen TJ, Dasso M: The RanGAP1-RanBP2 complex is essential for microtubule-kinetochore interactions in vivo. Current biology : CB 2004, 14(7):611-617.
7. Menendez-Montes I, Marin-Vicente C, Mukherjee S, Ahmed MS, Gomez MJ, Anene-Nzelu CG, Lee CJM, Koslowski S, Solmonson A, Tassin T et al: Mitochondria directly interact with the nuclear pore complex. Nature 2026, 654(8119):786-797.
8. Kotera I, Iwasaki T, Imamura H, Noji H, Nagai T: Reversible dimerization of Aequorea victoria fluorescent proteins increases the dynamic range of FRET-based indicators. ACS chemical biology 2010, 5(2):215-222.
9. Clarke P, Trefely S: Mitochondria tethered to the nucleus secure its energy supply. Nature 2026, 654(8119):605-606.
转载请注明来源于【GTP研发中心】
声明：本文仅用于分享，不代表GTP研发中心立场，若有侵权，请及时联系我们第一时间更正！
