技术分享：内质网输出COPII识别亲和力可调控STING信号强度
cGAS-STING信号通路在先天免疫、炎症、癌症及神经退行性疾病中发挥着重要作用。环状鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）可识别细胞质中双链DNA（dsDNA），并催化合成环状鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP），后者作为第二信使激活干扰素基因刺激因子（STING）[1]。STING是一种内质网（ER）驻留膜蛋白，以二聚体的形式存在，在与cGAMP结合后发生寡聚化，并从ER转运至高尔基体，该过程由COPII囊泡介导[2]。在高尔基体上，STING招募来TANK结合激酶1（TBK1），促使TBK1通过反式自磷酸化被激活。活化的TBK1对STING和转录因子干扰素调节因子3（IRF3）进行磷酸化，随后磷酸化IRF3二聚体转移到细胞核中，从而介导I型干扰素基因的转录[3]。因此，STING的ER输出对于激活cGAS-STING下游信号通路至关重要。
COPII负责货物分选及从ER到高尔基体的顺向囊泡运输[4]。COPII的组装始于SEC12招募SAR1，并将SAR1结合的GDP交换为GTP[5]。激活的SAR1-GTP招募SEC23/SEC24异源二聚体，其中SEC24作为货物结合的支架平台[6]。哺乳动物细胞表达四种SEC24亚型（SEC24A–D），可根据同源性分为两个亚类，SEC24A/B亚类与SEC24C/D亚类识别不同的货物基序：SEC24A/B识别货物蛋白中的双酸性基序、双疏水性基序和LxxLE基序，而SEC24C/D识别尚不明确的IxM包装信号。货物结合后，SEC23/SEC24招募SEC13/SEC31异源四聚体，进而驱动膜弯曲和囊泡形成[6]。最终，这些蛋白质组装成笼状复合体，即COPII囊泡，包含一个内壳（Sec23/Sec24/货物）和一个外层笼子（SEC13/SEC31）。然而，COPII囊泡介导的STING ER输出的具体分子机制目前尚不清楚。
2026年5月，Cell期刊报道了一项研究，鉴定出人源STING序列的339EEVTV343基序是COPII囊泡货物结合蛋白SEC24C所识别的内质网（ER）输出信号。STING的ER输出选择性依赖于SEC24C，这种依赖是通过STING与SEC24C上的IxM货物结合位点相互结合而实现的。突变EEVTV基序或IxM都会破坏STING的转运与信号转导功能。EEVTV是次优的ER输出基序，其与SEC24C的结合亲和力并非最强，使得能够调控STING从ER输出的速率和程度，防止免疫系统过度激活。通过工程化改造获得的“超强ER输出”STING具有组成型活性，始终处于激活状态，以此诱导了强效的抗肿瘤免疫反应。该研究阐明了STING的ER输出机制，为调控STING信号通路提供了新的策略[7]。
首先，研究者重新评估SEC24各亚型在STING信号通路中的作用。针对四种SEC24亚型设计靶向sgRNA，在敲除鼠源Sting并表达携带HA标签人源STING的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中分别进行基因敲除。添加STING小分子激动剂diABZI后，通过RT-qPCR检测下游靶基因Ifnb和Cxcl10的表达水平，以此作为STING成功转运和激活的检测指标。与先前报道相一致，证实了SEC24C是STING信号通路所需的主要亚型。为探究SEC24C如何结合STING，使用AlphaFold3预测人源全长SEC24C与STING二聚体的复合物结构（hSEC24C:hSTINGx2）。有趣的是，原先认为在STING的胞质配体结合区LBD和C端TBK1结合基序（TBM）之间的连接区为无序序列，而AlphaFold3预测在形成复合物后，连接区内形成了一段短的β链（339EEVTV343）。该β链通过与SEC24C的一个β链形成小型反平行β折叠片，从而与SEC24C的货物结合沟槽相互作用（图一A-C）。SEC24C的货物结合沟槽（895LIL897）即已知的IxM结合位点，负责选择性识别特定货物如GOSR2和STX5。但与所有SEC24亚型中被充分表征的B位点不同[8]，IxM结合位点的研究相对较少。预测STING的339EEVTV343与SEC24C可形成多个接触位点，例如E339和E340的侧链分别通过静电相互作用与SEC24C的R840和S888结合，而V341和V343的主链原子通过氢键与SEC24C的L895和L897接触（图一B）。
图一 鉴定出人源STING的339EEVTV343为ER输出基序[7]
由此，研究者对上述预测位点进行STING基序突变研究，设计为E339K、E340K、E339K/E340K、V341E/V343E和V341Q/V343Q，旨在改变残基电荷或疏水性，以破坏STING与SEC24C之间的接触。在StingKO MEF细胞中表达野生型STING或突变体，各组表达水平相当（图一D），但所有突变体在诱导Ifnb或Cxcl10表达方面都存在缺陷（图一E）。可见野生型STING在diABZI刺激1小时后从ER转运至高尔基体，表现为与高尔基体标志物GM130的强共定位；且在刺激8小时后，由于溶酶体降解，STING信号几乎不可见（图一F）。相比之下，大多数STING基序突变体在diABZI刺激后8小时内均未与高尔基体共定位，仍滞留在ER上（图一F）。评估细胞内STING与SEC24C的相互作用，在表达FLAG-SEC24C和HA-STING的细胞中采用邻位连接技术进行检测。在对照处理的细胞中检测到微弱的PLA信号，而在cGAMP或diABZI刺激后，PLA信号显著增强（图一G），表明配体激活STING可促进SEC24C的招募。与野生型STING相比，E339K/E340K和V341E/V343E突变体与SEC24C的PLA信号均显著降低（图一H），表明突变体与SEC24C的结合能力显著减弱。为确定STING是否直接结合SEC24C，研究者纯化重组STING-FL（全长1-379）和139-379（胞质区），以及后者引入V341E/V343E突变。同时纯化重组SEC24C（309-1094），该片段缺乏N端无序区，但包含货物结合结构域。重组STING-FL和139-379均能与SEC24C体外免疫共沉淀（图一I），但V341E/V343E突变蛋白与SEC24C的体外相互作用发生减弱（图一J）。以上数据表明,339EEVTV343是STING通过SEC24C介导ER输出所必需的序列。
已知SEC24C在STING信号通路中发挥作用，但其功能结构域尚未被鉴定。为探究SEC24C货物结合沟槽的突变对STING转运及信号转导的影响，研究者构建了Sec24ckoStingko的MEF细胞，并表达人源HA-STING、以及野生型或突变型人源FLAG-SEC24C（图二A）。R840D和S888E突变蛋白的表达水平与野生型SEC24C相当，而L895A/L897A、I896E和E899R突变蛋白的表达水平低于野生型SEC24C（图二A）。值得注意的是，除E899R外，其他SEC24C突变体均降低了diABZI刺激的Ifnb和Cxcl10表达（图二B），提示E899位点对结合影响不大（图一B）。进一步分析SEC24C货物结合位点的三个单点突变体R840D、S888E和I896E，发现均导致STING的ER输出受损（图二C）。邻位连接实验显示，HA-STING与野生型FLAG-SEC24C之间存在强相互作用，但与这三个SEC24C单点突变体无明显互作（图二D）。此外，利用纯化蛋白进行免疫共沉淀实验。与SEC24C野生型相比，I896E突变体与STING的体外相互作用减弱（图二E）。以上数据表明，SEC24C的IxM结合位点对于STING的ER输出及其信号转导功能至关重要。
图二 SEC24C的IxM结合位点是STING ER输出及信号转导所必需[7]
R284S是一种导致功能获得型疾病的人源STING突变体，可自发寡聚化并转运至后高尔基体囊泡[9]。接下来，研究者利用自激活型STING突变体R284S进行C端的截短研究。此前STING截短研究已鉴定出C端存在多个重叠的功能基序：C端尾部（CTT，344-379）、miniCTT（343-354）、TBK1结合基序、IRF3结合基序、衔接蛋白复合物1结合基序，以及未折叠蛋白反应基序（322-343，图三A）。339EEVTV343 ER输出基序恰好位于这些已定义结构域的中间，为确定该基序的功能，在突变体R284S基础上分别截短至氨基酸334、338、343和350。在StingKO MEF细胞中分别表达STING野生型、R284S全长、或R284S截短突变体（图三A），并通过共聚焦显微镜分析STING的亚细胞定位。在没有配体刺激的情况下，STING野生型定位于ER，而R284S全长定位于高尔基体。未包含该基序的截短突变体Δ334和Δ338仍定位于ER，而包含该基序的Δ343和Δ350则定位于高尔基体（图三A）。为验证这一结果，也在野生型STING中构建类似的截短突变体，并用diABZI刺激细胞（图三B）。同样的，diABZI可诱导STING野生型和STING-Δ343发生ER向高尔基体的转移，但STING-Δ334和STING-Δ338则不能（图三B）。此外，C末端增加外源性ER输出基序DxE的STING-Δ334（STING-Δ334-DxE），在diABZI刺激下也成功转运至高尔基体（图三B）。
图三 STING ER输出基序是向高尔基体运输的必要且充分条件[7]
进一步测试该输出基序是否足以介导非相关货物蛋白的ER输出。选择PRA1作为模型，该蛋白在稳态下依赖C末端的双酸性基序转运至高尔基体[10]。结果显示，缺失C末端的PRA1-ΔTail大量滞留于ER，而PRA1-ΔTail增加了EEVTV基序的PRA1-ΔTail-STING可显著恢复高尔基体定位（图三C）。为生化验证EEVTV输出基序与SEC24C的结合，进行了GST下拉实验。发现与单独GST相比，GST-EEVTV能够有效下拉更多的SEC24C蛋白，而突变体EEETE则不行（图三D）。此外，SEC24C的IxM突变体（I896E）也削弱了EEVTV与SEC24C的相互作用（图三E）。以上数据表明，ER输出基序EEVTV是STING从ER转运到高尔基体的必要且充分条件。
通常COPII货物是组成性从ER输出，但STING的ER输出需要配体的刺激才能被SEC24C介导。一种可能的解释是别构调节：配体结合可能改变STING ER输出基序的构象，使其能够被SEC24C识别。为验证这一假设，研究者将VSV-G的DxE基序添加在全长STING的C末端（STING-DxE），理论上DxE位于C末端应完全暴露。有趣的是，在静息状态下STING-DxE仍滞留于ER，且向高尔基体的运输仍然需要diABZI的刺激（图四A）。因此，别构调节机制似乎不成立。
图四 STING的寡聚化是其ER输出所必需的[7]
另一种可能性是STING的寡聚化能够克服SEC24C与STING二聚体之间的低亲和力相互作用。将纯化的STING-FL蛋白与cGAMP或diABZI共同孵育，可形成高度有序的寡聚体。STING-FL与SEC24C能够发生免疫共沉淀，cGAMP处理可增强这种相互作用，并且STING的胞质区139-379也能与SEC24C发生免疫共沉淀（图四B），证实了两者的相互作用是通过其胞质区所介导。然而，cGAMP不能增强SEC24C与STING胞质区之间的相互作用（图四B），后者因缺乏跨膜结构域，无法形成稳定的寡聚体，提示了STING寡聚化对于增强与SEC24C的结合至关重要。进一步使用BB-Cl-脒处理细胞，该药物可通过共价修饰Cys148抑制STING的寡聚化[11]。BB-Cl-脒处理后，显著阻断了diABZI诱导的STING ER输出（图四C）。此外，测试了破坏寡聚化的已知STING突变体，其中Q273A/A277Q突变可破坏STING的寡聚化界面，而C148A突变则影响旋转及寡聚化所需的构象变化[12]。结果显示，这两种突变体在diABZI刺激后均无法从ER输出（图四D）。邻位连接实验显示，与野生型STING相比，这两种突变体在diABZI刺激后招募的SEC24C显著减少（图四E）。以上数据表明，STING的寡聚化是其ER输出所必需的。
最后，研究者探究这一结合调控ER输出机制的生理意义。使用AlphaFold3预测了九种已知货物蛋白与SEC24C的结合模式[13]，其中四种货物蛋白NleA、STX5、GOSR2和 RTN3的结合预测获得了大于0.5的ipTM评分，具有高置信度。这四种货物蛋白均含有一个β链，与STING相似结合在SEC24C的同一沟槽上，但这四种蛋白与SEC24C的结合序列均显著长于STING的ER输出基序（图五A）。此外，与STING相比，NleA的结合基序EDVVIDIE预测与SEC24C存在两个额外的接触位点G839和R1090（图五B）。为验证NleA预测基序与SEC24C的IxM位点的结合情况，分别使用GST或GST-EDVVIDIE进行下拉实验，检测与野生型SEC24C或I896E突变体的免疫共沉淀。结果显示，EDVVIDIE与野生型SEC24C有强结合，结合强度显著高于STING的EEVTV，但与I896E突变体无结合（图五C和D），表明对于SEC24C的IxM结合位点，NleA基序比STING基序具有更强的结合亲和力。
图五 STING利用次优ER输出基序以避免免疫信号的过度激活[7]
接下来，研究者尝试将STING的339EEVTV343替换为NleA基序EDVVIDIE，设计出一个超强ER输出STING突变体（STING-NleA）。在免疫共沉淀实验中，STING-NleA与SEC24C的相互作用强于野生型STING（图五E）。随后进行HEK293T/IFN-Luc报告基因实验，该细胞系不表达内源性cGAS或STING，常用于检测STING信号活性。表达STING功能获得型SAVI突变体V155M和R284S的细胞，荧光素酶活性相比野生型STING分别升高了3倍和232倍；值得注意的是，表达STING-NleA的荧光素酶活性相比野生型STING升高了521倍（图五F）。进一步在STING-NleA中引入R238A/Y240A突变以消除cGAMP结合能力，发现该突变并未影响活性（图五G），表明STING-NleA可不依赖配体结合，直接激活干扰素信号。免疫印迹分析显示，仅表达STING-NleA即可诱导强烈的稳态pSTING、pTBK1和pIRF3水平，且cGAMP刺激后不再进一步升高（图五H）。STING-NleA的这种高活性并非依赖于组成性寡聚化，因其与本底野生型STING相似，主要以二聚体形式存在（图五I）。在StingKO MEF细胞表达STING-NleA，可组成性地定位于高尔基体；而引入两个破坏SEC24C结合点突变[14] 的STING-NleA-mt（EDVVADAE）失去了高尔基体定位（图五J），以及干扰素信号活性（图五K）。以上数据表明，STING天然存在的短且低亲和力的ER输出基序，是一种防止免疫过度激活的调控机制。以此构建的超强ER输出突变体STING-NleA，因与SEC24C的高亲和力，组成性定位于高尔基体，不依赖配体就能强力激活干扰素信号, 具有强效抗肿瘤活性。
综上所述，该研究鉴定出人源STING的内质网（ER）输出信号339EEVTV343基序，可与SEC24C的IxM货物结合沟槽相结合。无论是EEVTV基序的突变，还是SEC24C结合沟槽的突变，都会导致二者的结合受损、STING的ER滞留、以及下游的干扰素信号减弱。STING天然339EEVTV343基序是一种次优的ER输出基序，与SEC24C的结合亲和力并非最强，这种机制使得细胞能够控制STING从ER输出的速率和程度，防止下游信号的过度激活，从而维持免疫稳态。此外，进化分析发现STING的ER输出基序在脊椎动物中高度保守，以EEΦxΦ为特征，足以介导非相关蛋白的ER输出。该研究阐明了STING的ER输出机制，揭示了该过程的可调控性及其生理意义，提出了调节STING信号转导强度的新途径。
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