技术分享：新增微蛋白和肽质注释，逐步扩充人类蛋白质组
描述蛋白质编码基因组的特性是研究人类健康的主要基础。基于人类基因组计划建立的参考注释项目GENCODE和UniProt，负责对蛋白质编码基因进行持续性整理与维护。随着时间推移，经典蛋白质编码基因的数量在不断优化与调整，而人类基因组是否编码远超~19,500个经典蛋白质编码基因之外的更多产物，一直是该领域研究的前沿热点。近期证据显示数千个未经注释的非经典开放阅读框（ncORF）能够翻译出小的多肽或蛋白质序列，这些产物被统称为微蛋白。ncORF及其编码的多肽现已被广泛报道为“暗蛋白质组”的一部分，它们在疾病遗传基础、癌症生物学机制研究和免疫治疗靶点方面具有重要潜力。然而，由于结构不确定和进化约束水平较低，GENCODE和UniProt很少将其归类为经典蛋白质。因此，存在着一个关键的知识空白：哪些ncORF能够产生微蛋白或替代性蛋白质分子，以及这些分子对人类蛋白质组的构成有何贡献。
2026年5月，Nature期刊在线发表了一项研究，报告了TransCODE国际联盟的合作成果，形成了一份关于非经典开放阅读框（ncORF）蛋白质水平证据的共识性图谱。通过对95,520项蛋白质组学实验的大规模分析发现，在7,264个ncORF中，约25%的ncORF能够产生可检测的肽段。研究者建立了将ncORF编码微蛋白归入人类蛋白质组的注释框架，并提出“肽质”（peptideins）这一新概念，用来指代功能潜力不确定的微蛋白。为了评估肽质的生物学意义，研究者还开发了名为ORBL的进化分析方法，确定进化约束的普遍存在，且与ncORF衍生肽的观测结果相关联。该研究提供了一套公共研究工具，有助于促进对人类蛋白质组中未充分研究成分的生物医学发现[1]。
2022年，成立了TransCODE国际联盟[2]，旨在为ncORF及其编码微蛋白的参考注释制定标准，联盟成员包括GENCODE、PeptideAtlas、人类蛋白质组组织-人类蛋白质组项目（HUPO-HPP）以及HUPO-人类免疫肽组项目（HUPO-HIPP，图一a）。利用ProteomeXchange质谱（MS）数据存储库，扩展PeptideAtlas平台的覆盖范围，整合了人类非HLA PeptideAtlas 2023-06版本（包含35亿个经蛋白酶消化产生的MS/MS谱图）和人类HLA PeptideAtlas 2023-11版本（包含来自人类白细胞抗原（HLA）数据集的2.4亿个MS/MS谱图），用于查询GENCODE支持的7,264个ncORF（图一b）。
图一 微蛋白注释的工作流程及其主要参与机构[1]
为确保检测质量，研究者设定蛋白质水平的诱饵估算错误发现率（FDR）低于0.1%，并要求蛋白质鉴定遵循HUPO-HPP制定的指南[3-5]，即：每条蛋白质需要有2条≥9个氨基酸的唯一比对肽段，且蛋白质的覆盖度需≥18个氨基酸，该类蛋白质被归类为经典（canonical）；如果一个蛋白质条目满足上述两条肽段标准，但其肽段无法映射到核心蛋白质组，则被称为非核心经典（non-core canonical）。此外还有额外的九个类别，包括不可区分代表性（indistinguishable representative）、不可区分（indistinguishable）、代表性（representative）、边缘区分（marginally distinguished）、归并（subsumed）、弱（weak）、以及针对各种模糊和冗余证据场景下的证据不足（insufficient evidence），相同（identical）类别分配给与另一条目序列相同的条目，而没有任何肽段证据的蛋白质被归类为未检测到（not detected）[6]。该分类方法使得非HLA版本在肽段水平上FDR极低，仅为0.0009%，HLA版本的FDR为0.0041%。这样的质量控制标准比先前的研究更为保守。结果如预期所见，在非HLA构建中，识别经典人类蛋白质的能力接近饱和，新增数据集带来的新蛋白质数量极少。
研究者使用常规肽段数据（96.3%的实验经胰蛋白酶消化）检测了7,264个GENCODE ncORF中哪些可编码微蛋白。结果发现，有484条肽段通过了FDR的最低阈值，映射出183个微蛋白（2.5%，图二a和b）。由于使用更多搜索引擎或放宽FDR阈值获益有限，且会引入假阳性，因此，为满足参考注释的可靠性，研究者手动检查了所有183个ncORF的MS谱图和核糖体图谱Ribo-seq数据。结果显示，在拥有两条及以上肽段的42个ncORF中，研究者共手动验证了30个，在仅有一条肽段的141个ncORF中，仅手动验证了36个（图二c和d）。微蛋白因体积小，在胰蛋白酶消化检测中可能被低估，使用替代蛋白酶可提高鉴定数和覆盖度，但总体数量仍有限。
图二 非HLA和HLA肽的组学数据库构建[1]
下一步，研究者在人类HLA PeptideAtlas 2023-11构建版本中搜索了ncORF编码的微蛋白。共检测到3,116条肽段，映射到7,264个Ribo-seq ncORF中的1,785个，占比24.6%（图二e和f）。其中，绝大多数（94.3%）肽段仅由HLA-I类分子呈递，在HLA-II类数据集中极少出现，表明ncORF编码微蛋白产生的肽段主要来源于细胞内翻译产物，而非细胞外来源。为了增强HLA鉴定结果的可靠性，研究者手动检查了859个HLA-I质谱谱图和691个匹配的Ribo-seq谱图，重点关注至少含有两条唯一映射肽段的ncORF（图二g）。结果显示，有88.7%的ncORF验证出Ribo-seq信号；在多个研究中报道的ncORF，验证率高达96.1%（419/436）；在单一研究中报道的ncORF，验证率为76.1%（194/255），表明绝大多数ncORF编码微蛋白的HLA-I肽段鉴定结果具有充分的支持证据。
HLA-I肽段结合预测结果与免疫肽组学数据之间的吻合度，可用于增强对稀有来源蛋白质如微蛋白的肽段鉴定。因此，研究者整理了6,479次MS运行中4,870次所用样本的HLA类型，并集体评估了2,711条长度在8-12个氨基酸之间的微蛋白肽段的计算机模拟HLA-I结合预测。结果显示，在分析的4,870次HLA-I MS运行中，88.5%（4,308次）的运行中检测到的HLA-I肽段超过70%被预测为结合肽（百分比排名评分<2%，图二i），微蛋白肽段与经典蛋白肽段同样可能被预测与注释的HLA类型结合（图二j）。然后，研究者使用结合预测将每条微蛋白肽段分配到最可能的HLA等位基因后，发现预测与检测肽段之间的一致性高达94.8%，这一结果在不同ORF生物型和来源材料如癌性或非恶性细胞系/组织中均保持一致（图二k）。
接下来，研究者探索是否存在关键决定因素，使得某个微蛋白或微蛋白的某一部分更可能在HLA-I免疫肽组学数据中被检测到。结果发现，氨基酸序列、长度和组织表达模式均在检测过程中发挥作用（图三a-e）。与未被检测到的微蛋白相比，被检测到的微蛋白的等电点升高，而被检测到的经典蛋白质则表现出等电点降低，序列疏水性上没有发现差异（图三a）。C端疏水性因ncORF生物型不同而异（反映序列背景），但检测到与未检测到的微蛋白之间无显著差异，不能解释可检测性（图三b）。微蛋白的C端部分被优先用于HLA呈递，且这种富集程度（20.3倍）显著强于经典蛋白（7.2倍，图三c），猜测可能因为末端加工肽段所需的切割较少所导致的。微蛋白的检测还和表达水平、组织类型有关，有些具有显著的组织特异性，与未被检测到的微蛋白相比，被检测到的微蛋白的RNA表达显著更高（图三d）。胃组织中ncORF编码肽段的比例略低（-0.6%），脊髓和子宫中略有富集（分别+0.8%和+3.1%），这些组织特异性的差异无法用RNA转录本的表达水平来解释（图三e），提示免疫肽组中存在ncORF翻译与呈递的组织特异性调控，尽管作用效果并不强。
图三 ncORF肽段检测的影响因素分析[1]
过去，ncORF及其编码微蛋白的生物学解释一直受限于它们缺乏明确的进化约束[7]，可能是常规方法[8]未能充分捕捉它们的约束性，揭示其进化来源。为解决这个问题，研究者创建了ORBL（ORF relative branch length）方法，利用多物种全基因组比对来量化“ORF状态”的保守性特征，不考虑氨基酸序列的保守性，而是评估起始密码子、终止密码子、阅读框的“开放性”的跨物种保守性，将保守性得分记为ORBLv（图四a）。短ORF的核苷酸序列可能因偶然因素被保留，从而混淆了ORBLv的保守性测量，为此研究者还开发了一个ORBL约束得分ORBLq，用于定义在同种生物型且长度相近的非翻译ORF中，ORBLv得分所处的分位数（图四a）。使用ORBLq发现很大比例的ncORF表现出进化约束（图四b-e）。例如在7,264个ncORF中，实际检测到ORBLq>0.9的ncORF数量为2,211个（30.4%），远高于预期的10%（图四b和c），表明大量ncORF确实受到进化约束。在7,264个ncORF中，包含2,915个上游ORF（uORF），实际检测到ORBLq>0.9的uORF数量为1,335个（45.8%），同样远高于预期的10%（图四c和d），表明uORF中受约束的比例尤其突出。在氨基酸保守性指标PhyloCSF得分[8]，仅有极少数ncORF得分正值，而PhyloCSF得分>10的在7,264个ncORF中仅143个（2.0%），在2,915个uORF中仅74个（2.5%，图四f），表明ORF状态的保守性与氨基酸序列保守性是两个不同的维度。
图四 ORBL工具概述[1]
为探究ORBL能否指导参考注释，研究者检验了进化约束与肽段水平可检测性的关联。结果发现，被HLA-I肽段检测到的ncORF，其ORBLq得分显著高于未被检测到的ncORF（图四e），这一差异在uORF和intORF子集中尤为显著（图四g）。以c8riboseqorf102为例，其具有高ORBLq得分0.98，表明在胎盘哺乳动物中ORF水平具有强保守性，而PhyloCSF得分为负30，表明其氨基酸序列不保守，但其微蛋白仍可通过免疫肽组学检测到（图四h）。最新被验证出的c11norep1位于BET1L基因内，也可以呈现HLA-I肽段证据（图四i）。以上结果表明，基于ORF状态的进化约束特征（ORFness）与ncORF编码微蛋白的HLA-I肽段检测显著相关。ORBL方法为解释ncORF的功能潜力提供了不同于传统氨基酸保守性评估的新维度。
为了开发一个标准化的分析框架和命名系统，用于ncORF的标准化注释。研究者利用Ribo-seq、蛋白质组学和免疫肽组学作为互补技术，对ncORF进行层级分类，简化注释流程和生物学解读，以最终识别出具备成为常规蛋白质编码基因潜力的ncORF（图五a）。研究者设计了一套基于层级的ncORF分类体系（图五a），其中层级1A定义为：在常规蛋白质组学和Ribo-seq数据中有足够支持，能够满足HUPO-HPP蛋白质验证指南[9]。研究者初步识别出20个符合层级1A标准的ncORF候选。对质谱肽段数据进行手动检查，进一步审查排除假阳性因素，如假基因序列、GRCh38基因组组装错误、Ribo-seq证据不足等，最终缩减至15个ncORF（图五b和c）。截至目前，GENCODE已将层级1A中的三个ncORF注释为蛋白质编码基因：CYP27B1中的c12norep105、ERVH48-1中的c21norep46、以及PIDD1中的c11riboseqorf4。PIDD1的c11riboseqorf4编码了一个171个氨基酸的上游重叠ORF（uoORF），近期已被作为功能性蛋白研究[10]。该uoORF肽段在非恶性组织样本、癌症样本和细胞系中均有发现，表明该蛋白具有生理学作用。以上实验结果表明，研究者成功建立并应用了基于层级的ncORF注释框架，筛选出15个高置信度的层级1A ncORF，其中三个已被GENCODE收录为蛋白质编码基因。验证了该系统将ncORF升级为常规蛋白质编码基因的有效性，为后续ncORF的标准化注释提供了可操作的路径。
图五 层级系统的概述[1]
尽管层级1A的ncORF被视为极具潜力的蛋白质编码基因，但该层级系统还考虑了其他具有强实验数据支持的ncORF，而它们目前往往还达不到蛋白质注释的阈值。为了推动这些ncORF的生物学研究，研究者引入了新兴的总称术语“肽质”（peptidein）来定义：一个经实验证实存在RNA翻译和蛋白质合成的ORF，但目前的数据尚不足以宣称其具有常规蛋白质编码基因的状态。影响“肽质”认定的因素包括：观察到的非HLA质谱肽段数量、质谱肽段是否仅在癌症样本中观察到、是否存在氨基酸水平的进化约束，以及机制性生物学研究是否阐明了ncORF编码微蛋白的功能（图五a）。研究者确定了三个可能符合“肽质”资格的ncORF子集（图五d），层级1B和2B包含了高置信度HLA-I证据（作为呈递的HLA配体）的ncORF，确认其蛋白质合成。现已有层级1B的3个候选被GENCODE收录注释为蛋白质编码基因[11]，分别为EIF5中的c14riboseqorf117、PTP4A2中c1riboseqorf55以及CGGBP1中的c3riboseqorf98。层级2A仅有一条胰蛋白酶肽段支持，因微蛋白太短无法产生多条肽段。事实上，在层级2A的39个候选中，21个ncORF有已验证的胰蛋白酶肽段、Ribo-seq数据和额外HLA肽段（图五e）。例如PSMC5基因中的c17norep146，得到HLA-I和HLA-II肽段支持，且Ribo-seq翻译水平远超同一基因位点的主CDS。这类肽质值得密切监测，随着未来研究生成的数据可能会将它们重新分类为蛋白质编码基因。以上结果表明，该层级系统有助于系统性追踪和评估这些处于“灰色地带”的微蛋白编码基因。
功能基因组学能帮助识别具有重要细胞生物学功能的ncORF，特别是那些编码泛必需蛋白的ncORF[12-16]。最后，研究者尝试整合基因敲除表型证据，以定义编码潜在泛必需蛋白的候选者。为了实现这一目标，研究者开发了一种逐步分析方法（图六a），包括：1）在8种人类细胞系中，对超过2,000个ncORF进行CRISPR-Cas9功能缺失筛选；2）根据RNA-seq和Ribo-seq数据过滤阳性靶点；3）检查HLA肽段证据；4）通过包含饱和诱变在内的25项CRISPR筛选的荟萃分析进行优先级排序；5）使用ORBL评估进化约束。此外，验证uORF敲除的表型与该mRNA上相邻编码区不同，需要利用CRISPRa数据排除uORF敲除通过上调抗增殖性CDS导致毒性的可能性[17]。结果显示，研究者共鉴定出51个ncORF表现为泛必需敲除特征，其中6个ncORF基于HLA肽段证据，符合候选肽质或蛋白质编码基因资格。这6个ncORF可进一步分为两组：c2riboseqorf47、c14riboseqorf118、c2riboseqorf55、c3riboseqorf106具有高ORBLq值（>0.9），表现出进化约束；而c10riboseqorf92、c6norep15具有低ORBLq值（<0.7），表明几乎没有ORF水平的约束。图六b展示了c2riboseqorf47（GMCL1基因的1B uORF）的高ORBLq得分、阳性PhyloCSF得分、跨物种翻译证据、HLA-I和HLA-II肽段，表明其产生了一个稳定的微蛋白，可以从细胞内和细胞外来源进行呈递，GENCODE已将其注释为蛋白质编码基因ENSG00000310604。以上结果表明，功能基因组学与进化分析、免疫肽组学相结合，能够有效识别具有潜在重要功能的ncORF。即使缺乏常规胰蛋白酶质谱支持，也能通过多证据整合将某些ncORF升级为正式蛋白质编码基因，c2riboseqorf47的成功注释为此类策略提供了范例。
图六 功能性ncORF的注释优化[1]
研究者利用已发表的ncORF饱和诱变筛选[12, 14]，设计了ncORF必需性功能富集评分系统，与局部背景信号，可能包含其他相邻的ncORF或CDS进行比较（图六c）。结果发现，c3riboseqorf106和c10riboseqorf92表现出选择性适应性丧失（图六d）。由于前者位于ZBTB11-AS1转录本中，此前已被研究[14]，研究者将重点放在后者。OLMALINC转录本有六个被GENCODE注释认可的ncORF，但只有c10riboseqorf92是唯一被评为泛必需遗传依赖性的ncORF，由123个氨基酸组成；重新表达c10riboseqorf92编码序列可挽救敲低导致的活力丧失表型（图六e和f），表明其具有ORF特异性功能。研究者进一步在超过485种细胞系中进行c10riboseqorf92敲除，发现415种（85.6%）细胞存活下降。进行转录组分析其与Dependency Map中其他泛必需基因的相关性，发现其敲除与有丝分裂和DNA损伤调控基因富集相关（图六g）。在A375细胞中，与OLMALINC敲低处理细胞相比，表达c10riboseqorf92的细胞可特异性上调513个基因的表达，下调456个基因，其中14个基因显示出统计显著的交互作用。GO分析差异调控基因与细胞代谢以及DNA损伤反应有关（图六h）。研究者又对12种c10riboseqorf92敲除细胞系的scRNA-seq数据进行分析[18]，与A375细胞数据一致，c10riboseqorf92敲除后诱导了有丝分裂和染色体相关过程，同时下调了翻译和代谢过程的相关基因的表达（图六i和j）。以上结果表明，OLMALINC编码的c10riboseqorf92是一个由123氨基酸组成的肽质，在多种细胞系中均表现出泛必需表型，其参与有丝分裂、DNA损伤修复和代谢调控。尽管功能证据充分，但因证据仅限于转化细胞系或癌症，缺乏正常生理学功能验证，故仍保留在“肽质”分类中，表明肽质可能具有重要的细胞功能，但需进一步研究其在正常生理中的作用。
综上所述，TransCODE国际联盟旨在凝练一个可推广的方法，以理解并注释哪些非经典开放阅读框（ncORF）产生了能够贡献于人类蛋白质组的小型微蛋白或替代性蛋白质分子。该研究结合了高通量核糖体图谱、质谱、免疫肽组学及单细胞测序等多组学技术，初步对7,264个ncORF的蛋白质水平证据形成共识性理解。逐步将微蛋白及替代性蛋白质分子纳入参考基因注释体系，将其定义为蛋白质编码基因或“肽质”（peptidein）。PeptideAtlas平台已公开提供所有ncORF、肽段和质谱谱图数据（https://peptideatlas.org/builds/human/#ncORFs）。该研究为人类蛋白质组中未被充分研究的组分提供了一种标准化的注释路径，有助于推动生物医学的新发现。
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