技术分享：CLCC1调控内质网膜平衡以维持脂质稳态
脂质是机体核心的能量来源和结构组成，其生成、储存与动员的协同调控对细胞及机体的稳态至关重要[1]。例如，血浆脂质调控功能失调是心血管代谢疾病的主要风险因素。细胞中内质网（ER）是脂质合成与分泌的核心枢纽，尤其在代谢活跃的肝细胞或肠细胞中尤为突出[2]。在ER的双层膜结构中，磷脂合成初始发生在胞质侧脂层，随后需翻转至ER腔侧脂层，以完成ER膜的组装。而中性脂质（如甘油三酯等）则在ER双层膜的脂层之间生成。在脂蛋白的组装初期，转运蛋白需要将中性脂质和磷脂跨膜转运至ER腔内的载脂蛋白B（APOB）上[3]，但这一过程的分子机制尚不明确。
2026年4月，Nature期刊报道了一项研究，发现内质网蛋白CLCC1参与磷脂的双层膜平衡，调控细胞脂质分布进而影响全身脂质稳态。机制上，CLCC1与磷脂翻转酶TMEM41B协同作用，识别失衡的双层膜结构并促进磷脂翻转，从而支持脂蛋白的生物合成及其后续脂质转运。缺失CLCC1或TMEM41B会导致内质网双层膜失衡，形成巨大的腔内脂滴，进而加速代谢功能障碍相关脂肪性肝炎的病理进程。鉴于跨双层膜磷脂平衡在从分解代谢性自噬到病毒感染等众多生物过程中的关键作用，该研究为理解内质网如何精确调控脂质的跨膜运动提供了关键的分子线索[4]。
具有两亲性结构的磷脂，其合成呈现跨膜不对称性：在内质网（ER）胞质侧脂层合成后，由磷脂翻转酶如TMEM41B将新合成的磷脂从ER膜的胞质侧翻转到腔面侧脂层。小鼠肝脏特异性敲除Tmem41b导致的磷脂翻转缺陷，不仅阻碍了中性脂质的装载及极低密度脂蛋白（VLDL）的生成，还引发了脂质大量合成，并显著加速代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）[5]。透射电子显微镜（TEM）显示，Tmem41b缺失肝细胞中数量众多的脂滴均被双层膜结构紧密包裹（图一a），这些双层膜结构可能源于ER。为进一步解析这种异常脂质储存形式，研究者结合高压冷冻固定技术对肝组织进行冷冻电子断层扫描（cryo-ET）成像。结果发现，在野生型（WT）肝细胞中，脂滴分布于胞质内，常与ER相邻，平均直径约50 nm（图一b）。而Tmem41b缺失肝细胞中的巨大脂滴被高度弯曲的ER双层膜包裹，平均直径约1 μm，其表面积远超ER管状结构（图一b）。这些巨大脂滴被ER双层膜紧密包裹于ER管腔内，该膜表面光滑无核糖体附着，紧密贴合着巨大脂滴的球面，呈现出弯曲形态（图一c）。
图一 CLCC1或TMEM41B缺失诱发形成巨大ER包裹脂滴（geLD）[4]
通过生化分离和银染技术，发现从WT肝脏纯化的常规胞质脂滴（cLD）与Tmem41b缺失肝脏来源的巨大ER包裹脂滴（geLD）具有截然不同的蛋白质组成（图一d）。定量质谱（MS）分析显示，cLD相关标志蛋白，尤其是脂滴包被蛋白PLIN2，在geLD中显著缺失，而这些异常脂滴却富集了特定的ER膜蛋白，如torsin蛋白家族、σ-1受体、细胞色素b5（CB5）及UGT1A9（图一e）。共聚焦显微镜验证了质谱结果：WT细胞中PLIN2定位于cLD膜上，但在TMEM41B缺陷细胞的geLD表面未见其分布（图一f）。geLD被ER膜标志蛋白GFP-CB5包裹，而WT细胞的cLD则没有（图一g）。免疫印迹进一步证实，geLD中缺少了cLD标志物如PLIN2、HSD17B13及脂肪分解酶ATGL，但富集了特定ER膜蛋白（图一h）。geLD中也缺乏了VLDL的主要结构载脂蛋白APOB，但含有可交换的APOE（图一h）。由于磷脂翻转功能缺陷，TMEM41B缺陷细胞形成了独特的geLD，并伴随出现胞质侧与腔面侧失衡的弯曲ER双层膜（图一i）。进一步将geLD富集的蛋白质组与TMEM41B翻转酶及SURF4货物受体相关的相互作用组进行整合分析（图一j），筛选出一系列候选蛋白，分别进行KO。其中以功能尚不明确的ER膜蛋白CLCC1最为突出，该蛋白在geLD组分中高度富集（图一e和h）。CLCC1缺失会诱导geLD的形成，这些geLD不被PLIN2包裹，却被GFP-CB5所包裹（图一l），与TMEM41B缺失表型高度一致。
串联亲和纯化实验显示，CLCC1与TMEM41B存在生化相互作用（图二a）。相应地，从肝组织或肝癌细胞的内源性TMEM41B免疫复合物中，可分离出内源性CLCC1（图二b）。此外，基于全球脂质遗传学联盟（GLGC）数据[6]进行的遗传分析显示，人源CLCC1基因的代表性单核苷酸多态性rs149700491与血浆脂质水平存在强关联（图二c和d）。rs149700491的次等位基因在不同种族中的频率均较低（图二e），提示CLCC1可能对脂质稳态具有显著的生物学效应。于是，利用CRISPR介导的基因编辑技术，在小鼠模型中急性诱导肝脏Clcc1缺失（图二f）。肝脏蛋白免疫印迹分析显示，两种sgRNA介导的Clcc1缺失均导致TMEM41B蛋白减少（图二g），而其转录水平未受影响。此外，APOB100蛋白也出现减少（图二g），反映了APOB脂化失败进而导致VLDL生成受阻。肝脏Clcc1缺失导致禁食小鼠血浆甘油三酯水平降至接近零，这种脂质耗竭可通过引入sgRNA耐受的Clcc1得以挽救（图二h）。通过尺寸排阻色谱法分析血浆脂质谱，也证实了致动脉粥样硬化脂蛋白包括VLDL和LDL的减少（图二i），血浆胆固醇水平亦观察到类似下降（图二j和k）。与脂质测定结果一致，肝脏Clcc1缺失小鼠血浆中的载脂蛋白包括APOB、APOA1和APOE也出现减少，而白蛋白水平未受影响（图二l）。在注射脂蛋白脂肪酶抑制剂tyloxapol[7]后，Clcc1缺失小鼠的肝脏甘油三酯分泌能力较对照组显著降低（图二m）。通过检测循环APOB蛋白水平及电镜负染色观察分离的脂蛋白，进一步证实肝脏Clcc1缺失导致脂蛋白的分泌减少（图二n和o）。
图二 CLCC1-TMEM41B调控批量脂质输出[4]
下一步，研究者探究CLCC1的脂质调控分子机制。AlphaFold3辅助的结构预测[8]显示，CLCC1可能以高分子量寡聚体形式组装成环状构型（图三a和b）。BN凝胶电泳分析，观察到Tmem41b缺失细胞中CLCC1寡聚体被诱导形成，且CLCC1寡聚体富集在geLD上（图三c），表明其优先定位于翻转酶缺陷所引发的失衡ER双层膜上。共聚焦显微镜显示，在WT细胞中内源性CLCC1弥散分布在整个ER中，而在TMEM41B缺失细胞中，CLCC1被招募并富集于包裹geLD的ER膜上（图三d）。为探究CLCC1与TMEM41B的作用机制（图三e），将Flag标记的TMEM41B瞬时转入翻转酶缺陷细胞中。结果显示，在细胞CLCC1存在的情况下，Flag-TMEM41B被招募至包裹geLD的弯曲膜上；但细胞缺失CLCC1时，这种招募现象并未发生，Flag-TMEM41B表现为ER的弥散分布（图三f和g）。进一步评估ER双层膜两侧炔基标记的PC总量，TMEM41B缺失细胞出现胞质侧PC积累（图三h）。CLCC1缺失也引起PC积累，尽管较TMEM41B缺失的程度轻些，而CLCC1与TMEM41B联合缺失并未加剧翻转缺陷（图三h和i）。此外，在体外脂质翻转实验中，无蛋白脂质体中约50%的荧光标记磷脂受到保护；当掺入高浓度的重组TMEM41B，荧光几乎完全淬灭；掺入低剂量TMEM41B仅引起荧光淬灭的适度增加；而掺入相似剂量的TMEM41B-CLCC1复合物，荧光下降幅度显著增大（图三j）。以上数据表明，CLCC1在翻转酶介导的ER双层膜平衡中发挥重要作用。
图三 CLCC1将ER磷脂失衡与磷脂翻转酶联系起来[4]
鉴于ER双层膜平衡在生物学中的基础性作用，研究者探索CLCC1对机体脂质稳态的贡献。通过CRISPR介导的肝脏Clcc1缺失，最早在第4周就加速了MASH的病理进程，且无需额外饮食诱导。Clcc1缺失小鼠肝脏呈现多种病理特征，包括外观发白、肝细胞气球样变、纤维化和免疫细胞浸润（图四a）。与对照组相比，Clcc1缺失肝脏的重量相比体重几乎增加一倍（图四b），可在水中漂浮（图四c），表现出显著的肝脂质积累（图四d），并伴有肝损伤（图四e）。回补sgRNA耐受的Clcc1可挽救相应表型缺陷（图四a-e）。TEM分析显示，WT肝细胞的ER呈现精细的网状结构，具有规则的腔体宽度和光滑末端；而Clcc1缺失导致大量geLD形成，并被弯曲的ER膜所包裹（图四f）。WT肝细胞的高尔基体中充满了VLDL颗粒，而Clcc1缺失肝细胞的高尔基体中VLDL颗粒完全缺失（图四g）。进一步分析联合缺失小鼠的肝脏表型，仅缺失Tmem41b导致MASH表型的快速出现，其程度略高于单独缺失Clcc1。然而，与仅缺失Tmem41b相比，Tmem41b和Clcc1的联合缺失并未进一步加重肝脏病理（图四h），表明这两个因子在脂质翻转的相同步骤中发挥作用，介导了ER双层膜平衡及脂蛋白的生物合成。以上数据表明，CLCC1负责维持肝脏ER结构稳态，ER膜持续失衡会导致严重病理后果。
图四 CLCC1负责维持肝脏ER结构稳态[4]
Clcc1缺失肝脏中伴随着脂生成酶LIPIN1、FASN和ACC1的大幅上调，而蛋白折叠相关的内质网分子伴侣如BIP和calnexin则保持不变（图五a）。脂质转运酶复合物MTP-PDI也出现升高（图五a），提示在ER膜的脂层失衡后，脂质转运增加，进而导致分配偏向。于是，研究者使用MTP药理学抑制剂处理CLCC1缺失细胞[9]，发现促使中性脂质从GFP-CB5标记的geLD重新定向至GFP-PLIN2包裹的小型脂滴（图五b和c）。为检测ER膜失衡与脂质分配偏向的普遍存在性，研究者设计了一对互补报告基因，将分裂型GFP片段分别与CLCC1和可交换的载脂蛋白APOE进行融合（图五d）。当单独表达CLCC1-GFP11和APOE-GFP1-10时，均不发出荧光。当共同导入TMEM41B缺失细胞后，两者高效互补发出的GFP荧光定位于巨型脂滴的表面；在WT细胞中，油酸处理也增加了GFP信号（图五e）。油酸处理促使内源性CLCC1重新定位，围绕在少量脂滴周围（图五f）。以上数据表明，在脂质跨ER膜的穿梭过程中，ER膜的脂层失衡可能广泛存在，脂质翻转是一个受到主动调控、用于维持动态平衡的生物学过程。为进一步探究ER膜脂层失衡的普遍存在性以及持续的双层不平衡所导致的代谢缺陷，研究者检测遗传性肥胖ob/ob小鼠肝脏，发现CLCC1蛋白水平均下调约50%，也观察到 TMEM41B蛋白水平的下调（图五g和h），表明ER膜的脂层失衡与肥胖模型的代谢缺陷相关。在ob/ob小鼠中，肝脏过表达CLCC1可减轻脂质积累（图五i和j），并改善肝脏损伤（图五k）。
图五 CLCC1可抵抗脂质诱导的应激[4]
综上所述，该研究将此前功能未明的内质网膜蛋白CLCC1鉴定为磷脂翻转酶催化内质网双层膜平衡过程中的关键调控因子，从而能够应对内质网在脂质生成与分布这一生理过程中普遍存在的脂层不平衡状态（图五l）。当脂质翻转不足或内质网双层膜的持续失衡，即使蛋白质稳态正常，也会引发严重的细胞及全身性病理变化。该研究强调了维持内质网膜脂质物理特性对机体健康的基础性作用，为研究内质网功能与疾病关系提供了一个新视角。
GTP研发中心负责实施基因组标签计划（Genome tagging project, GTP），基于自主知识产权的类精子干细胞介导半克隆技术，为全基因组的功能基因一一贴上标签，致力于构建标签细胞和标签小鼠资源库。类精子干细胞是从精子来源单倍体囊胚中建系获得的一种孤雄单倍体胚胎干细胞，将其注入卵母细胞，能够像精子一样支持整个胚胎发育过程，产生健康的半克隆小鼠。GTP研发中心在类精子干细胞的蛋白质编码基因上原位敲入标签序列，建立了液氮保存的标签细胞资源库。研究需要时，利用半克隆技术将标签细胞注射到小鼠卵母细胞中，一步法获得标签小鼠。
已有标签产品可直接订购，详情查阅以下官网链接。如有需要欢迎联系，我们将竭诚为您服务。
标签细胞网址：
标签小鼠网址：
http://www.sibcb.ac.cn/gtp/msearch.jsp
地址：上海市岳阳路320号
责任编辑：甜点
新媒体运营：suway
参考文献
1. Mathiowetz AJ, Olzmann JA: Lipid droplets and cellular lipid flux. Nat Cell Biol 2024, 26(3):331-345.
2. Wang X, Chen XW: Cargo Receptor-Mediated ER Export in Lipoprotein Secretion and Lipid Homeostasis. Cold Spring Harbor perspectives in biology 2023, 15(6):a041260.
3. Sirwi A, Hussain MM: Lipid transfer proteins in the assembly of apoB-containing lipoproteins. Journal of lipid research 2018, 59(7):1094-1102.
4. Wu L, Wang J, Wang Y, Yang J, Yao Y, Wang Y, Huang D, Hu Y, Xu X, Wang Ret al: CLCC1 governs ER bilayer equilibration to maintain lipid homeostasis. Nature 2026, 652(8109):471-480.
5. Huang D, Xu B, Liu L, Wu L, Zhu Y, Ghanbarpour A, Wang Y, Chen FJ, Lyu J, Hu Y et al: TMEM41B acts as an ER scramblase required for lipoprotein biogenesis and lipid homeostasis. Cell Metab 2021, 33(8):1655-1670.e1658.
6. Graham SE, Clarke SL, Wu KH, Kanoni S, Zajac GJM, Ramdas S, Surakka I, Ntalla I, Vedantam S, Winkler TW et al: The power of genetic diversity in genome-wide association studies of lipids. Nature 2021, 600(7890):675-679.
7. Wang X, Wang H, Xu B, Huang D, Nie C, Pu L, Zajac GJM, Yan H, Zhao J, Shi F et al: Receptor-Mediated ER Export of Lipoproteins Controls Lipid Homeostasis in Mice and Humans. Cell Metab 2021, 33(2):350-366.e357.
8. Abramson J, Adler J, Dunger J, Evans R, Green T, Pritzel A, Ronneberger O, Willmore L, Ballard AJ, Bambrick J et al: Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature 2024, 630(8016):493-500.
9. Rader DJ, Kastelein JJ: Lomitapide and mipomersen: two first-in-class drugs for reducing low-density lipoprotein cholesterol in patients with homozygous familial hypercholesterolemia. Circulation 2014, 129(9):1022-1032.
转载请注明来源于【GTP研发中心】
声明：本文仅用于分享，不代表GTP研发中心立场，若有侵权，请及时联系我们第一时间更正！
