技术分享：先导组装采用线性DNA供体实现大片段基因组插入
许多遗传性疾病是由不同基因座上的多种突变引起的，这要求制定精准化的基因治疗策略。然而，目前高效且准确地进行大片段DNA插入或替换的手段仍然有限，难以选择一次性覆盖患者群体大部分或全部突变的编辑策略来进行治疗。传统的靶向整合或替换基因DNA片段的方法依赖于非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）对DNA双链断裂（DSB）进行修复[1]。这些方法存在一定的局限性。DSB可能引发不受控制的插入/缺失突变并激活p53，导致DNA损伤和细胞毒性[2]。在供体DNA存在的情况下，DSB可以通过HDR进行精确修复，但在原代细胞和体内环境中，HDR对大片段DNA插入的效率通常较低[3]。
近期，先导编辑（PE）相关技术取得不错进展，将其结合丝氨酸整合酶已能实现基因组上的大片段插入[4]。然而，这些方法通常在插入位点产生瘢痕序列。复杂的结构元件和较大的分子量也增加了体内递送难度，包括有PE/重组酶效应蛋白、质粒供体和先导编辑向导RNA（pegRNA）模板。质粒的体内摄取效率较低，还可能诱发先天免疫反应[5]。此外，整合酶的体内临床安全性研究并不充分。鉴于这些挑战，在治疗性应用方面，亟需开发一种无痕、无质粒、无整合酶的系统，以实现高效、不依赖HDR、且精准的大片段DNA插入。
2026年4月，Nature期刊在线报道了一种先导组装（prime assembly，PA）技术，在双先导编辑（twinPE）基础上，通过引入线性DNA供体，即可实现大片段基因组插入。PA技术突破了原技术的大片段插入效率低这一瓶颈，成功实现了一个或多个重叠DNA片段的精准插入，测试的总插入长度范围在0.1 kb至11 kb。PA技术依赖于体外制备的DNA模板，无需共递送外源DNA聚合酶，且不依赖经典的同源定向修复途径。该研究为细胞内基因组编辑提供了一种有潜力的新工具[6]。
研究者此前已开发双先导编辑（twinPE）、DNA聚合酶编辑等相关技术[4, 7, 8]。可是，这些方法对于插入大于800 bp基因片段的效率并不高。由于PE能够高效产生30-40个核苷酸的单链flap结构，研究者推测：设计一种线性双链DNA（dsDNA）供体，使其末端与twinPE产生的flap相匹配，是否可以绕过外源聚合酶介导合成的局限性，实现大片段DNA的插入。为验证这一假设，研究者开发了一种先导组装（PA）方法，通过PCR产生的dsDNA供体，其末端与twinPE所产生的可编程单链 flap 序列同源（图一a）。将编码先导编辑器PE6c的质粒、靶向AAVS1位点的twin-epegRNA（A和B，各带有35个核苷酸的flap），以及线性dsDNA供体共同转染至HEK293T细胞后，发现成功实现了0.8 kb DNA片段的高效插入（图一b）。在对照组样本中未检测到插入条带，这些对照组包括：无供体组、环状质粒模板组、无逆转录酶（RT）组以及非同源pegRNA对照组（图一b）。序列分析表明，PA技术在插入片段的两侧均能产生精确的连接点（图一c）。在相同的AAVS1靶点位置，将PA与evoCAST及PAINT 3.0方法进行直接比较[9]。结果显示，PA在实现更高插入效率的同时，所需组分更少，凸显了PA技术的简便性与通用性（图一d）。重要的是，在HEK293T细胞中，PA技术还能有效地将2.2 kb和4 kb的供体片段插入到AAVS1位点（图一e）。
图一 开发先导组装（PA）技术采用dsDNA供体进行大片段插入[6]
进一步分析flap长度对PA效率的影响，发现30个和50个核苷酸的flap介导了高效的编辑，而13个核苷酸的flap仅能产生极弱的编辑效果。比较不同GC含量的35核苷酸flap后，观察到GC含量为54%的flap介导的PA效率最高。为分析PA插入的全基因组特异性，使用一种改进的PE-tag/UDiTaS检测方法，称为PA-tag（图一f）。该方法使用供体特异性引物和转座酶标记技术来检测插入位点，不依赖于基因组位点特异性引物[10]。将该方法应用于转染了AAVS1 PA组分的细胞时，PA+dsDNA组在预期的AAVS1位点显示出特异性的插入信号，而在仅供体对照组中该信号不明显（图一g）。分析PA编辑的精准度，对每个插入连接点进行扩增子测序，结果显示，精确的连接序列占读长的83-88%，而插入缺失突变（indels）占12-17%。为控制扩增或测序错误，对每个连接序列对应的合成gBlocks基因片段进行扩增子测序。结果显示，91-92%的读长具有精确的连接序列。考虑到gBlocks基因片段合成的错误率估计为1:5,000，即0.02%，扩增子测序误差约占不精确连接序列读长的8-9%，因此实际编辑精准度可能接近95%。以上结果表明，PA能够实现大片段DNA在基因组中的精准插入。
既往研究表明，细胞内调控因子以及DNA修复机制活性会影响先导编辑的效果[11]。于是，研究者使用小分子抑制剂分别阻断RAD51（B02）、MRE11-RAD50-NBS1复合物（mirin）、DNA-PK与PI3K（NU7026）、有丝分裂（nocodazole）、PARP（olaparib）、Polθ（ART558）以及DNA-PK（AZD-7648），分析它们对PA技术的影响。在这些抑制剂中，DNA-PK抑制剂AZD-7648提高了插入效率（图二a和b）。在AZD-7648处理的细胞中，PA介导的indels从12-17%下降至9-12%，表明抑制DNA-PK可提高PA插入的准确性。并且PA技术在CDK4/6抑制剂或微管聚合抑制剂处理的细胞中仍然具有功能，表明PA不依赖细胞周期的进程。为了使PE产生的flap能够与DNA供体退火，dsDNA供体的5'末端必须先被置换或切除。因此，研究者假设：去除0.8 kb供体的5' 末端，得到具有3' 突出末端的双链DNA（3′-odsDNA）供体，能否支持PA。使用λ噬菌体5′→3′核酸外切酶对0.8 kb供体进行5' 末端切除，从而生成3′-odsDNA供体（图二c）。为防止5' 末端被过度切除，在与flap同源区域相邻的位置引入五个内部硫代磷酸酯键（图二c）。结果显示，这种0.8 kb的odsDNA通过PA技术可在AAVS1位点实现20-40%的插入效率（图二d和e）。与未经修饰的dsDNA供体相比，odsDNA供体实现了33.2%的插入效率（图一d和图二e），并且提高了编辑精准度。PA-tag实验证实，PA+odsDNA同样具有较高的全基因组特异性（图二f）。值得注意的是，使用DNA-PK抑制剂AZD-7648处理后，odsDNA介导的插入过程中indels的发生频率显著降低，降至gBlock对照的背景indel水平。以上结果表明，DNA-PK抑制剂AZD-7648与3′-odsDNA可以提高PA的插入准确性和效率。
图二 DNA-PK抑制剂AZD-7648与3′-odsDNA可以提高PA的插入准确性和效率[6]
接下来，为克服长片段PCR扩增带来的供体合成限制，研究者测试了分段式供体组装的可行性。模拟Gibson组装原理，将0.8 kb的dsDNA供体分割成两个片段，在这两个片段之间设计30 bp的重叠序列用于连接（图三a）。在没有AZD-7648处理的情况下，分割供体能够支持PA介导的0.8 kb插入，效率约为30%（图三a-c）。此外，AZD-7648处理提高了插入效率和准确性（图三b和d）。在不使用AZD-7648时，观察到6.5%的indels，其中大部分对应于两个供体片段之间的NHEJ连接事件。然而，在AZD-7648存在下，indels比例降至2%（图三d）。Sanger测序证实，供体片段在细胞内被正确组装并插入（图三e）。将重叠长度固定为30 bp，并改变其GC含量。结果显示，相较于其他测试条件，40-60%的GC含量介导了更高的PA插入。经过一系列的优化，研究者建议将重叠区的GC含量控制在40-60%左右以最大化效率，重叠长度不低于30 bp，因其能够在支持高效PA编辑的同时，最小化所需的供体DNA长度。进一步尝试将AAT基因的1.9 kb分割为三个片段组装到AAVS1位点中，观察到三段式PA技术的成功整合（图三f）。同样地，AZD-7648处理后插入效率有所提高（图三f），纳米孔测序证实了插入的精准性。当使用4个或6个供体片段时，插入效率有所下降（图三g），表明使用2或3个分段供体可获得最佳性能。以上结果表明，分段式供体组装能够在哺乳动物基因组中精准插入大片段DNA。
图三 分段式供体组装能够在哺乳动物基因组中精准插入大片段DNA[6]
最后，研究者测试PA技术能否介导抗肌萎缩蛋白DMD基因11.3 kb全长cDNA的基因组整合，将其插入HEK293T细胞的AAVS1位点中（图四a）。将经过柱纯化的11.3 kb DMD PCR供体、PE6c以及双twin-epegRNA共同转染到HEK293T细胞中。三天后，收集细胞提取基因组DNA，通过微滴式数字PCR（图四b）以及连接点区域的PCR测序（图四c），证实了DMD供体的精确插入。使用位于插入位点两侧之外的引物进行PCR扩增整个插入片段，琼脂糖凝胶电泳分析进一步验证了全长11.3 kb的插入（图四d）。与之前的结果一致，经AZD-7648处理后插入效率有所提高（图四d）。另外，还测试了CD19特异性嵌合抗原受体（CAR）基因能否高效插入到HEK293T细胞的TRAC位点。结果表明，2.4 kb的CD19-CAR-P2A-GFP序列通过PA技术成功整合到了TRAC位点（图四e和f）。以上数据表明，PA技术能成功在治疗相关位点实现大片段DNA的整合。
图四 PA技术实现DMD基因与CAR基因的定点插入[6]
综上所述，该研究开发的先导组装（prime assembly，PA）技术，利用双先导编辑（twinPE） 的精准切口功能与体外预制的线性双链DNA供体，可在哺乳动物细胞中实现0.1 kb至11 kb的大片段定点插入。此外，3' 突出末端的双链DNA（3′-odsDNA）和单链DNA供体同样能够支持PA技术介导的大片段插入。分段式供体组装策略可在一定程度上解决长片段DNA供体制备的困难，直接在哺乳动物细胞内实现对多个供体片段进行同步拼接组装。PA技术不依赖于细胞低效的从头合成，也不依赖于DNA双链断裂、长同源臂和额外的重组酶元件，具有成本低、扩展性强和适应性高的特点，为哺乳动物细胞的大片段基因插入提供了一种有潜力的新工具。
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