技术分享：线粒体输入机器MIM复合体的调控脂滴稳态新功能
线粒体是细胞代谢与信号传递的核心细胞器，包含了1000余种蛋白质，其中大部分是在细胞质核糖体上合成，随后通过翻译后易位进入线粒体[1]。因此，线粒体外膜需要一套调控各种线粒体蛋白质的转运输入与组装机制，以保证其功能稳态。线粒体外膜上包含两类整合膜蛋白：跨膜β-桶蛋白和跨膜α-螺旋蛋白，也都在细胞质核糖体上进行合成。其中，β-桶蛋白的数量较少，在酵母和人类线粒体外膜中仅发现五种不同的β-桶蛋白[2]。β-桶蛋白前体通过线粒体外膜转位酶（TOM）复合体转运穿过外膜，随后在分选与组装机器SAM（也称TOB）复合体的帮助下，β-桶蛋白正确折叠并插入到外膜中[3]，构成跨膜通道，用于蛋白质或代谢物的运输。
相比之下，具有单个或多个α-螺旋跨膜片段的α-螺旋蛋白占整合外膜蛋白的90%以上，其功能涉及广泛，涵盖从蛋白质生物合成、膜动力学到代谢过程、信号转导和质量控制等。与β-桶蛋白前体的转运途径不同，α-螺旋蛋白并非采用通用型线粒体入口TOM复合体[4]，而是线粒体输入机器MIM复合体作为其主要插入酶，负责单次和多次跨膜α-螺旋外膜蛋白直接插入到外膜中[5]。MIM复合体是由Mim1和Mim2两个亚基形成异源寡聚体，由多个Mim1拷贝构成主要部分，并组装了一或两个Mim2拷贝[6]。MIM复合体可以直接作为蛋白质插入酶发挥作用；或者根据底物不同，与TOM受体协同将前体蛋白靶向至外膜；也可以与SAM复合体结合以组装输入的蛋白质[7]。然而，MIM复合体在细胞器互作和代谢调控中的功能仍然不清楚。
2026年3月，Nature Cell Biology期刊报道了一项研究，发现线粒体输入机器MIM复合体调控脂滴稳态的新功能。MIM复合体除了与前体蛋白结合帮助α-螺旋蛋白插入线粒体外膜，还可结合脂质代谢酶Ayr1形成MIM-Ayr1复合体，促进线粒体-脂滴接触位点形成以及维持脂滴稳态。Ayr1通过单一疏水段序列以底物模拟机制结合MIM复合体，但始终保持结合状态，并不释放插入外膜。该研究揭示了一种线粒体转位酶的捕获机制，竞争性将膜蛋白复合体从蛋白质插入功能转换成脂质代谢调控功能，大大拓宽了对线粒体膜蛋白复合体功能多样性的理解[8]。
首先，为了鉴定MIM复合体的结合伙伴，研究者在酵母细胞的内源性Mim2上添加了HA标签。制备其线粒体组分，使用非离子型洗涤剂毛地黄皂苷进行裂解，亲和纯化后对Mim2结合蛋白质进行质谱分析。结果显示，另一个MIM亚基Mim1被高效共纯化，以及分选与组装机器SAM复合体的亚基（图一a），这与已报道的 MIM-SAM 复合体相互作用一致[9]。此外，还鉴定出脂质代谢酶Ayr1是MIM复合体的主要相互作用伙伴，其共纯化效率与核心亚基Mim1相当（图一a）。研究者进一步验证这一相互作用，发现带有HA标签的Mim2能下拉到Ayr1（图一b）；反之，带有His标签的Ayr1也能下拉到Mim1和Mim2（图一c）；使用 Mim1特异性抗体进行免疫共沉淀，也能从野生型线粒体中下拉到Ayr1（图一d）。为排除裂解后发生相互作用的可能性，混合带有不同标签的线粒体。将单独带有Protein A标签的Ayr1（ProtAAyr1）线粒体与单独带有HA标签的Mim2（HAMim2）线粒体相混合，通过ProtAAyr1进行亲和纯化，可下拉到未标记的Mim1和Mim2，但带标签的HAMim2则不行（图一e），表明Ayr1与MIM复合体在天然线粒体环境中存在特异性相互作用。
图一 MIM复合体与脂质代谢酶Ayr1的相互作用[8]
接着探究在缺乏脂滴的情况下，Ayr1能否与MIM复合体相互作用。在一个同时缺失三酰甘油合成酶Dga1和Lro1、麦角甾醇酯合成酶Are1和Are2的酵母菌株中，表达HA标记的Mim2，发现在无脂滴的条件下，Ayr1与HAMim2的相互作用基本未受影响（图一f），提示Ayr1能够与线粒体外膜上的MIM复合体直接结合，并不依赖脂滴。免疫荧光证实了酵母中线粒体与His标记的Ayr1存在共定位（图一g）。为探究这些聚集点是否代表线粒体与脂滴的接触位点，在酵母中共表达GFP-Ayr1、线粒体靶向BFP以及与mCherry融合脂滴蛋白Erg6，显示出这三种蛋白的共定位。以上数据表明，Ayr1在紧邻脂滴的线粒体外膜上与MIM复合体发生相互作用。
随后，研究者探究Ayr1对线粒体外膜蛋白生物合成的影响。在酵母细胞中删除AYR1基因的开放阅读框（ayr1∆）。通过变性和非变性凝胶电泳检测，发现在野生型线粒体与ayr1∆细胞的线粒体中，外膜转位酶MIM、TOM 和SAM复合体的含量相当。体外合成MIM复合体的典型底物Tom6和Ugo1的前体并进行放射性标记，然后导入分离的线粒体，进行蓝色非变性凝胶电泳分析。Tom6是TOM复合体的一个小亚基，是单次跨膜α-螺旋蛋白。在ayr1∆线粒体中，Tom6通过三种中间体组装到TOM复合体中的过程基本未受影响（图二a），而ayr1∆线粒体中Ugo1的转运略有减少（图二b）。Ugo1是多次跨膜的α-螺旋蛋白，在酵母中参与线粒体融合。有报道磷脂酸（PA）特异性支持Ugo1的膜插入[10]。因此，研究者分析ayr1∆线粒体的磷脂组成。发现大多数磷脂的水平保持不变，但PA含量适度减少（图二c），表明Ayr1缺失不会损害MIM复合体的蛋白质转运活性，但会部分影响线粒体的磷脂组成。
图二 Ayr1调控脂滴稳态[8]
使用中性脂质染料BODIPY 493/503 对ayr1∆细胞脂滴含量进行分析。荧光显微镜观察显示，与野生型相比，缺失Ayr1时脂滴数量减少，而过表达Ayr1时脂滴数量则增加（图二d和e），表明Ayr1在脂滴稳态中发挥作用。磷酸酶Nem1是脂滴生物发生的重要刺激因子，可激活PA磷酸酶Pah1，将PA转化为二酰甘油，随后生成三酰甘油并形成脂滴[11]。在缺乏Nem1的情况下，脂滴的形成减少（图二f），此时过表达Ayr1并不能增加脂滴数量（图二f），表明Ayr1依赖于Nem1途径促进脂滴的生物发生。在浅蓝菌素处理后，脂肪酸生物合成可被抑制，细胞从三酰甘油储存中动员脂肪酸，导致脂滴降解（图二g）。此时过表达Ayr1，能显著抵消浅蓝菌素处理后的脂滴减少（图二g）。以上数据表明，Ayr1可调控脂滴的形成及其稳态。
接下来，研究者探究Ayr1能否将脂滴招募至线粒体。分离野生型和过表达Ayr1的线粒体，进行质谱比较。过表达Ayr1的线粒体，出现许多脂滴蛋白如Pdr16和Erg1的显著富集（图三a），表明Ayr1可能促进脂滴与线粒体的结合。采用分裂型Venus蛋白测试线粒体与脂滴的体内结合（图三b），分别将Venus蛋白氨基端与线粒体Tom70蛋白相融合（Tom70-VN），以及将羧基端与脂滴蛋白Faa4相融合（Faa4-VC）。当两种蛋白在线粒体-脂滴接触位点彼此靠近时，即可恢复Venus的荧光。与野生型细胞相比，过表达Ayr1时荧光信号增加，而缺失Ayr1时荧光信号减少（图三c），表明Ayr1能促进脂滴与线粒体在空间上的接触。然而，过表达Ayr1会导致线粒体碎片化以及细胞生长缺陷，影响线粒体稳态（图三d和e）。Ayr1属于短链脱氢酶家族，具有保守的罗斯曼折叠结构。为研究Ayr1酶活性的影响，构建了两种突变体：NADPH结合受损的G20,22A突变体和酶活性受损的S18A突变体（图三f）。在ayr1∆细胞中分别表达Ayr1或突变体，发现过表达Ayr1增加了线粒体-脂滴接触位点的数量以及脂滴的总数，但突变体未能产生这些效应（图三g和h），表明Ayr1的酶活性是促进接触位点形成和脂滴稳态所必需的。
图三 Ayr1促进线粒体与脂滴之间接触位点的形成[8]
基于MIM复合体与Ayr1的相互作用，研究者探究MIM复合体是否与脂滴稳态功能相关。通过亚细胞分级分离，在富含线粒体的组分P13、微粒体（富含内质网）组分P100、以及上清组分S100中均检测到Ayr1（图四a），这与Ayr1存在于包括线粒体、内质网和脂滴在内的多个细胞区室中的情况一致。在缺失Mim1的情况下，线粒体中的Ayr1池显著减少（图四a），表明 MIM复合体是Ayr1有效募集到线粒体所必需的。在mim1∆线粒体中，Mim1底物如Tom20和Tom70的稳态水平降低，而其他线粒体蛋白包括Tom40和Por1则不受影响。分析碳饥饿条件下转录组mRNA的水平变化，观察到Mim1的表达增加，这与Ayr1的表达趋势相似，而TOM和SAM复合体亚基的转录水平则呈现不同的调控模式（图四b）。在mim1Δ细胞，脂滴数量出现显著减少（图四c），同时缺失mim1∆ ayr1∆也没能继续减少脂滴数量（图四c），表明Mim1和Ayr1在同一通路中调节脂滴稳态。在mim1∆细胞中，浅蓝菌素处理后的脂滴降解加速（图四d）。反之，过表达Mim1能增加脂滴数量（图四e），以及增加线粒体-脂滴接触位点的荧光信号（图四f）。以上数据表明，Mim1将Ayr1招募至线粒体，促进线粒体-脂滴接触位点的形成以及脂滴稳态。
图四 MIM复合体将Ayr1招募到线粒体，并调节脂滴稳态[8]
Ayr1的C端包含了一个疏水段（HyS），为探究其功能，研究者构建了仅缺失疏水段的突变体Ayr1∆HyS（图五a）。野生型和突变型Ayr1的过表达水平相当，通过亚细胞分级分离和线粒体纯化，观察到HyS疏水段是Ayr1定位到线粒体所必需的（图五b和c）。过表达Ayr1而非Ayr1∆HyS促进了脂滴标志蛋白Pet10向线粒体的募集，并显著提高线粒体组分的中性脂质水平（图五c和d），表明HyS疏水段促进了Ayr1的线粒体靶向、以及脂滴与线粒体的结合。Ayr1的疏水段包含了一个预测的α-螺旋结构，其长度足以跨越双层膜。α-螺旋跨膜结构域是MIM复合体转运底物的基本元件。为探究Ayr1的疏水段能否被其他外膜蛋白的跨膜结构域TMD所替代，研究者在Ayr1∆HyS的末端分别融合了Tom5 TMD或Ubc6 TMD（图五a）。Tom5是TOM复合体的一个小亚基，是单次跨膜α-螺旋蛋白。而Ubc6不是经典的线粒体蛋白，是内质网的尾锚定蛋白。与野生型Ayr1（图五b）不同，Ayr1-Tom5TMD非常有效地靶向线粒体，几乎只在线粒体组分中被发现（图五e）。测定每个细胞的脂滴数量，过表达Ayr1∆HyS未能增加脂滴数量，Ayr1-Tom5TMD仅观察到轻微的增加（图五f）。作为对照的Ayr1-Ubc6TMD，未能增加脂滴数量（图五f）。有趣的是，在促进线粒体-脂滴接触位点形成方面，过表达Ayr1-Tom5TMD甚至比过表达天然Ayr1更有效（图五g）；相比之下，影响线粒体定位的Ayr1∆HyS没有显著影响（图五g）。同样的，只有过表达线粒体定位的野生型Ayr1和 Ayr1-Tom5TMD才会导致线粒体碎片化和细胞生长受损（图五h和i）。以上数据表明，Ayr1通过其HyS疏水段介导的线粒体靶向，来促进脂滴稳态以及线粒体与脂滴之间接触位点的形成。
图五 Ayr1疏水段介导其线粒体定位以及维持脂滴稳态[8]
最后，研究者分析Ayr1如何锚定在线粒体外膜上。在碱性pH条件下对线粒体进行碳酸盐提取后，外周膜蛋白和可溶性蛋白会被提取出来，而整合膜蛋白则保留在膜碎片中[12]（图六a）。Ayr1在提取实验中表现出特殊分布，可同时分布在上清和沉淀中，表明Ayr1通过蛋白质相互作用附着在膜上，并未完全插入脂质环境[13]。为研究Ayr1与MIM复合体的相互作用，使用毛地黄皂苷裂解线粒体，通过带His标签的Ayr1进行亲和纯化，进行蓝色非变性电泳分析。MIM复合体呈现出以一种主要形式和一种更大的复合物形式的迁移模式[9]，而与Ayr1共纯化下拉到的主要为更大的复合物形式（图六b）。使用AlphaFold进行结构预测，显示Ayr1疏水段形成了一个α-螺旋发夹结构（图六c），实验发现Ayr1并非通过其疏水结构域跨越线粒体外膜，而是通过一个α-螺旋发夹结构锚定在线粒体和MIM复合体上，其N端和C端均暴露于胞质侧。
图六 Ayr1通过底物模拟机制与MIM复合体结合[8]
过表达Ayr1后，放射性标记的Ugo1前体与MIM复合体的相互作用被减弱了，而过表达靶向线粒体缺陷的Ayr1∆HyS则不影响Ugo1-MIM复合体之间的相互作用（图六d），表明Ayr1竞争性阻断MIM复合体的底物结合位点，导致MIM-Ayr1无法与前体蛋白相互作用。将放射性标记的Ugo1前体分别导入野生型、带标签的Ayr1、或带标签的Mim1的线粒体中，通过标签亲和纯化，只有Mim1能够共纯化Ugo1前体，Ayr1则不行（图六e），表明Ayr1不参与构成结合前体蛋白的转运酶复合体。反之，进一步制备带His标签的Ugo1前体，将其导入野生型线粒体。结果显示，带标签的Ugo1前体能下拉Mim1和Mim2，但不能下拉Ayr1（图六f）。以上数据表明，Ayr1和外膜前体蛋白不能同时结合MIM复合体，二者是竞争关系，Ayr1可阻断MIM复合体的底物结合位点。
综上所述，该研究发现了脂质代谢酶Ayr1是线粒体外膜上MIM复合体的相互作用伙伴，Ayr1通过C端疏水段序列以底物模拟机制捕获MIM复合体，进而在两种细胞器之间建立稳定的接触结构，促进线粒体-脂滴接触位点的形成以及脂滴稳态的维持（图六g）。该研究揭示了MIM复合体参与调控脂滴稳态的新功能，巧妙地将线粒体蛋白质输入、细胞器膜接触和代谢调控这三个看似独立的过程连接在一起，为理解细胞器互作调控脂质代谢与线粒体功能提供了全新的分子机制。
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