技术分享：DHX29识别并介导富含非最优密码子的mRNA降解
蛋白质的翻译过程与mRNA的降解密切相关。同义密码子不仅编码着相同的氨基酸序列，是蛋白质折叠及其稳态的关键决定因素，还在翻译偶联mRNA降解的调控中发挥重要作用[1, 2]。能够促进翻译快速延伸的最优密码子，通常伴随着蛋白质产量的增加和mRNA稳定性的延长。相反，富含非最优密码子的mRNA（非最优mRNA）则会被快速降解，并表现出较低的翻译效率[3, 4]。这种由密码子介导的影响效应在物种间广泛存在，但最优与非最优密码子的分类方式因物种而异。人类密码子主要可分为以GC结尾的最优密码子（GC3）和以AU结尾的非最优密码子（AU3）[4]。这种基于GC3/AU3的同义密码子使用方式影响着多种细胞过程，例如亚细胞mRNA定位、假基因化以及抗病毒防御机制。
同义密码子如何影响真核细胞mRNA降解的分子机制目前仍存在争议。在酿酒酵母中，由非最优密码子导致的核糖体减速可被Dhh1p和CCR4-NOT mRNA去腺苷酸化复合物所感知[5]。机制上，由于解码速度缓慢而产生的空A位点，会导致CCR4-NOT复合体的组分Not5识别处于空置状态的E位点[6]。在人类细胞中，CNOT3在核糖体停滞时可能与E位点相互作用[7]。然而，有研究指出，这种相互作用倾向于发生在特定精氨酸密码子占据P位点时，基于其特定结构构型[8]。尽管招募CCR4-NOT复合物通常与核糖体减速相关，但与酵母不同，在人类细胞中该复合物更倾向于靶向富含精氨酸密码子的mRNA。CNOT3这种选择性密码子敏感性增强，提示可能存在其他作用更广泛的因子，参与调控人类细胞中非最优mRNA的识别和降解过程。
2026年3月，Science期刊在线报道了一项研究，通过人类细胞的全基因组CRISPR筛选，鉴定出RNA结合蛋白DHX29是密码子依赖性mRNA表达的关键调控因子。DHX29直接与翻译中80S核糖体的A位点入口相互作用，且优先与解码AU3密码子即非最优密码子的80S核糖体相互作用。同时DHX29可招募GIGYF2•4EHP复合物，进而广谱性抑制了非最优mRNA的表达。该研究颠覆了遗传学传统认为的“同义突变是中性的”这一认知，为深刻理解细胞分化、癌症发生等众多生理、病理过程提供了全新视角[9]。
首先，为探究同义密码子对基因表达调控的潜在作用因子，研究者利用同义突变报告基因进行全基因组CRISPR筛选。报告基因选择了小鼠同源标志物CD45.1和CD45.2，二者仅有五个氨基酸差异，其余氨基酸序列基本一致，可被特异性抗体区分[10]。通过同义替换设计密码子优化的CD45.1构建体（CD45.1-OPT），将其GC3含量提高到95.0%（图一A），而野生型CD45.2（CD45.2-WT）的GC3含量仅为43.8%。在表达Cas9的K562细胞中稳定表达这两种报告基因，然后转导全基因组gRNA文库（图一B）。当相关调控因子被敲除后，非最优mRNA的表达就能显著增加，为此分选出CD45.2-WT/CD45.1-OPT比值较高的细胞进行测序。使用casTLE分析流程对样本中富集的gRNA进行分析，鉴定出260个高置信度的候选基因，其中RNA结合蛋白DHX29具有较高的casTLE评分且为显著正效应（图一C）。
图一 DHX29 在全转录组范围内广谱抑制非最优mRNA的表达[9]
DHX29是一种DExH蛋白，可与43S前起始复合物结合，是翻译起始所必需的[11]。流式细胞术分析验证，在K562细胞中转导靶向DHX29的gRNA（DHX29-KO）后，CD45.2-WT/CD45.1-OPT比值升高（图一D和E）。为研究DHX29对全转录组的影响，采用两种独立方法下调DHX29：CRISPR介导的敲除（DHX29-KO）和CRISPR干扰介导的敲降（DHX29-KD）。RNA-seq分析显示，与对照组相比，在两种处理细胞中富含AU3的mRNA均广谱上调，其中DHX29-KD更为显著，可能与其急性敲降反应有关（图一F和G）。此外，采用SLAM-seq分析mRNA降解速率，在HEK293T DHX29-KO细胞中，非最优转录本的mRNA半衰期显著性延长（图一H和I）。以上数据表明，DHX29是一个能区分最优或非最优密码子以调控基因表达的潜在因子，可在全转录组范围内广谱性抑制非最优mRNA的表达。
接下来，研究者探究DHX29介导这一调控过程的分子机制。为了鉴定与DHX29相互作用的蛋白质，在HEK293T细胞中表达FLAG-DHX29，然后使用3,3'-二硫代二丙酸亚氨酸酯（DSP）进行交联，以保留弱的和瞬时相互作用。随后，收集细胞裂解液，先进行RNase I处理以探究不依赖于RNA的相互作用，再使用FLAG抗体进行免疫沉淀。对FLAG-DHX29共沉淀物进行的质谱分析显示，DHX29与60S亚基以及40S亚基的多种蛋白质均有相互作用（图二A和B）。免疫共沉淀实验证实DHX29与uL10（60S亚基组分）和uS12（40S亚基组分）的相互作用（图二C）。使用识别60S亚基组分uL10/P1/P2的抗体，进行反向免疫共沉淀分析也证实了60S亚基与DHX29的相互作用（图二D）。此外，uL10/P1/P2抗体也能下拉内源性DHX29，表明这种相互作用发生在生理条件下。进一步探究翻译中的核糖体是否与内源性DHX29结合，对HEK293T细胞进行多聚体分级分离，实验组进行细胞内交联，对照组则未进行。结果显示，交联并未改变多聚体图谱，也未影响40S和60S亚基的分布（图二E和F）。交联后，检测到DHX29与80S、多聚体以及40S的相互作用（图二 E和F），表明DHX29与80S核糖体相互作用，并可能在翻译延伸阶段发挥作用，而非仅限于起始阶段。
图二 DHX29直接与翻译中的80S核糖体相互作用[9]
通过捕获复合物的单颗粒冷冻电子显微镜快照，证实了DHX29直接与80S核糖体的相互作用。DHX29的双链RNA结合结构域（dsRBD）占据了80S核糖体的A位点入口位置，该位置通过卷曲螺旋结构域与由N端结构域、RecA1、RecA2、翼状螺旋结构域（WH）、Rachet结构域和OB-fold结构域组成的解旋酶模块相连（图二G和H）。尽管DHX29的dsRBD结构与典型的dsRBD结构相似，但暂未观察到该结构域与RNA的相互作用。解旋酶模块位于40S亚基的头部与主体之间，其中RecA1/A2结构域的分辨率相对较低，表明它们具有结构柔性（图二H）。将该结构与先前报道的含有A位点和P位点tRNA的人源80S结构进行叠加，结果显示DHX29 并不会与已就位A 位点的tRNA发生碰撞。又将该结构与先前报道的人源eEF1A•GTPγS•氨酰-tRNA•80S复合物结构进行叠加，此结构代表了A位点tRNA就位之前的密码子识别或采样状态，显示出DHX29的dsRBD在空间上阻碍了eEF1A将氨酰-tRNA招募至A位点（图二I）。以上结果表明，在氨酰-tRNA采样过程中，80S核糖体与DHX29的相互作用以及与eEF1A•GTP•氨酰-tRNA三元复合物的相互作用是相互排斥的。
随后，研究者探究DHX29与翻译中核糖体A位点入口的相互作用对于抑制非最优mRNA的表达是否重要。分别构建了全长蛋白、缺失dsRBD和卷曲螺旋结构域的突变体（ΔdsRBD+Coil）、以及仅包含卷曲螺旋结构域C端部分（该部分与解旋酶模块连接）的ΔdsRBD突变体（图三A和B），随后在表达CD45同义报告基因的DHX29-KO细胞中进行回补实验。结果显示，仅有回补野生型全长蛋白DHX29能够恢复CD45.2-WT/CD45.1-OPT的低比值，而回补突变体ΔdsRBD+Coil或ΔdsRBD都不行（图三B和C）。检测DHX29的dsRBD与A位点入口之间界面，发现DHX29与40S核糖体的eS30和uS12结合（图三D）。DHX29的S373和T375位于与uS12相互作用的界面处（界面1，图三E）。而DHX29的Q452、S453、Q456和L457则参与结合eS30（界面2，图三F）。进一步评估各氨基酸残基的贡献，发现回补界面1突变体T375Y或S373A/T375A，都未能恢复CD45.2-WT/CD45.1-OPT的低比值（图三G）。针对界面2，回补单点突变S453Y或Q456A能够恢复该比值（图三H），表明这两个位点对相互作用的影响不大。然而，回补单点突变L457Y或四点突变Q452A/S453A/Q456A/L457A均未能恢复该比值（图三H），表明这些残基在相互作用中起着重要作用。以上结果表明，破坏DHX29的dsRBD结构域与80S核糖体A位点入口接触的任一界面，就足以消除DHX29区分最优或非最优密码子以调控基因表达的能力。
图三 DHX29与核糖体A位点入口的相互作用对于抑制非最优mRNA的表达至关重要[9]
接下来，研究者评估DHX29这种抑制效应的密码子偏好性。通过富集FLAG-DHX29结合的核糖体，进行选择性核糖体图谱分析（图四A）。结果显示，在DHX29结合的核糖体样本中，起始密码子和终止密码子周围均存在3nt周期性，并且足迹不仅位于起始密码子周围，还遍布整个编码序列（图四 B和C）。进一步分析DHX29结合的核糖体足迹在A位点是否存在密码子偏好性，发现DHX29对于解码AU3密码子，尤其是仅包含AU核苷酸密码子的核糖体具有更高的偏好性（图四D）。对于大多数氨基酸而言，DHX29结合的核糖体对其他同义密码子的偏好性均低于对AU3密码子的偏好性（图四E）。计算每个编码序列的DHX29结合占有率，发现与GC3含量呈负相关（图四F）。此外，当DHX29-KD后，原DHX29高占有率的mRNA表达水平都大幅增加（图四G），表明DHX29结合的mRNA易被降解。以上结果表明，DHX29倾向于与解码AU3密码子的核糖体直接结合，从而抑制非最优mRNA的表达。
图四 DHX29偏好与解码AU3密码子的80S核糖体结合[9]
最后，研究者探究DHX29这种抑制效应所依赖的下游分子。分析相互作用的蛋白质，发现DHX29共沉淀了众多RNA结合蛋白、核糖体蛋白以及CCR4-NOT复合物的组分（图二A和B），表明其参与了转录后调控的广泛的蛋白质网络。其中，GIGYF2•4EHP复合物与抑制核糖体停滞mRNA表达相关[12]。4EHP可结合mRNA的5’帽结构，从而竞争经典的翻译起始因子eIF4E。而与4EHP结合的GIGYF2可招募参与mRNA降解的因子。于是，研究者推测GIGYF2•4EHP复合物可能参与DHX29介导的非最优mRNA表达抑制。利用CRISPR干扰介导的敲降系统，构建了下调GIGYF2或4EHP的K562细胞，进行RNA-seq分析。与DHX29-KD细胞的结果类似，在GIGYF2-KD或4EHP-KD细胞中，非最优mRNA的表达在全转录组范围内被广谱性上调（图五 A和B），以及这些在DHX29-KD、GIGYF2-KD和4EHP-KD细胞中特异性上调的基因具有较高的重叠性（图五C）。此外，对DHX29/4EHP双敲降细胞进行RNA-seq分析，发现在DHX29缺失的背景下，进一步缺失4EHP并未观察到非最优mRNA水平的进一步上调（图五D）。以上数据表明，DHX29通过与GIGYF2•4EHP复合物相互作用来抑制非最优mRNA的表达。
图五 DHX29通过GIGYF2•4EHP复合物来抑制非最优mRNA表达[9]
综上所述，该研究发现了RNA结合蛋白DHX29在人类细胞中全转录组水平上广谱性抑制非最优mRNA的表达。机制上，DHX29直接与80S核糖体的A位点入口相互作用，可竞争eEF1A•GTP•氨酰-tRNA三元复合物与核糖体的结合。偏好性上，DHX29更优先与解码非最优AU3密码子的核糖体相结合。当DHX29结合到核糖体A位点入口时，可招募GIGYF2•4EHP复合物，后者介导了非最优mRNA的降解，最终表现出同义密码子使用依赖性的基因表达模式（图五E）。该研究回答了"人类细胞如何识别并清除携带非最优密码子的mRNA"这一长期悬而未决的问题，揭示了一个以DHX29为核心的从非最优密码子识别、翻译暂停到mRNA清除的完整分子通路，颠覆了传统观念中“同义突变是中性的”这一认知，为深刻理解细胞分化、癌症发生等众多生理、病理过程提供了全新视角，以及为优化mRNA疗法提供了全新思路。
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