技术分享：PDAD8液相分离属性协调细胞器接触位点

真核细胞具有多种亚区室，分别形成不同的化学环境来实现功能特化。经典的膜结合细胞器如线粒体或高尔基体，通过脂质双分子层与细胞质分隔开。近年研究表明，某些大分子能在没有明确膜结构或支架的情况下自组装成区室，形成含有独特微环境的生物分子凝聚体[1]。这种生物分子凝聚体形成的“无膜细胞器”，往往是通过液-液相分离（LLPS）这一热力学过程所形成。该过程高度可逆，受蛋白质浓度、温度、离子强度等多种因素调控。凝聚体的界面也被视为细胞质中的特化区域，这些区域可以积累电荷，产生独特的化学环境，从而触发蛋白质寡聚化或加速氧化还原反应[2, 3]。

近期，有研究将膜接触位点（MCS）也描述为一类独特的亚区室，即两种不同细胞器膜紧密并列但未融合的区域，间距通常在10至30 nm之间[4]。线粒体-内质网接触位点（MERCS）是其中一种最常见的MCS。MERCS富含特定的蛋白质、脂质和mRNA，在多种生物活动的调控中发挥着关键作用，例如参与调控钙信号传导、脂质转移和细胞凋亡。此外，MERCS标志着线粒体分裂位点，并与线粒体DNA合成相偶联，从而调控线粒体功能[5]。有研究表明，定位于内质网的含PDZ结构域蛋白8（PDZD8）在神经元活动期间对维持钙稳态至关重要[6]。PDZD8又被证实定位于内质网与晚期内体/溶酶体之间的接触位点[7]，并参与这些MCS上的非囊泡脂质转移[8]。然而，PDZD8如何广泛地参与并调控内质网表面的多种接触位点，其机制尚不明确。

2026年1月，Molecular Cell期刊报道了一项研究，发现内质网驻留膜蛋白PDZD8，通过其内在无序区（IDR）在膜接触位点（MCS）发生相分离形成凝聚体，介导了内质网与线粒体、溶酶体等其他细胞器之间的稳定粘附。PDZD8在脂质界面处凝聚，充当一种粘结框架，将相邻细胞器连接在一起，以支持细胞器间通信的结构和功能完整性[9]。

首先，研究者检测破坏液-液相分离（LLPS）是否会影响线粒体-内质网接触位点（MERCS）的大小，使用脂肪族醇1,6-己二醇（1,6-HEX）进行广泛破坏。通过扫描电子显微镜定量MERCS投影面积，结果显示在对照HeLa细胞中，线粒体周长约有7.3%与内质网接触。然而，经3% 1,6-HEX处理5分钟后，平均接触面积显著减少至5.6%，而线粒体大小和长宽比未受影响（图一A和B）。使用阴性对照的结构异构体2,5-己二醇（2,5-HEX）处理，未观察到MERCS大小的减少（图一A和B），表明该效应是1,6-HEX破坏低亲和力疏水相互作用所特有的。于是，研究者推测维持MERCS可能需要LLPS，考察了凝聚体-膜相互作用的蛋白质，PDZD8因其独特的序列特征和分布模式而脱颖而出。PDZD8包含多个结构域：一个N端跨膜结构域（TM）、突触结合蛋白样线粒体脂质结合结构域（SMP）、PDZ结构域、C1结构域、分裂的C2结构域、卷曲螺旋结构域（CC），以及长链酸性内在无序区域（IDR，图二A）。IDR之间的多价弱相互作用可诱导LLPS[10]，研究者使用配备超分辨Nikon空间阵列共聚焦探测器的共聚焦显微镜观察内源性标记的PDZD8-Venus时，偶尔可见其沿线粒体呈平面状凝聚体分布（图一C），表明内源性PDZD8凝聚体具有润湿两个相对膜面的潜力（图一D）。而过表达PDZD8则弥散分布于内质网上。在他莫昔芬诱导的Pdzd8条件性敲除小鼠的胚胎成纤维细胞中，单位线粒体周长上的MERCS长度相比对照组MEF显著减少，且Pdzd8敲除与3% 1,6-HEX处理并未表现出叠加效应（图一E和F），表明PDZD8以LLPS依赖的方式形成MERCS。

图一 1,6-己二醇处理以PDZD8依赖性方式减少MERCS[9]

为确定PDZD8的IDR能否形成生物分子凝聚体，研究者纯化了多种PDZD8截短体进行体外重构实验（图二A）。在生理条件下，PDZD8-IDR能够形成生物分子凝聚体，并且在光漂白后荧光恢复实验中表现出快速的荧光恢复（图二B）；以及在模拟生理环境的3%聚乙二醇8000存在下，浓度低至5 μM时即可形成生物分子凝聚体（图二C）。由于离子强度可影响相分离过程，发现PDZD8-IDR蛋白凝聚体在较高NaCl浓度下发生分散（图二D），表明其形成依赖于电荷介导的相互作用。此外，其他PDZD8截短体如EGFP-SMP-PDZ-IDR和BFP-PDZ-IDR，也能在凝聚体中共定位（图二E），表明PDZD8-IDR介导的LLPS，是在脂质转运（通过SMP结构域）和支架功能（通过PDZ结构域）之外的又一特征。近年来的理论模型与实验数据表明，膜可能作为触发蛋白质“预润湿”的局部枢纽[11]，这是一种热力学相变现象，即便胞质蛋白浓度低于整体相分离所需的阈值浓度，蛋白质仍能在膜表面形成分子层厚度的凝聚层。为探究PDZD8-IDR是否能在膜上形成凝聚层，利用含氮川三乙酸-镍（NTA-Ni））锚定基团的脂质，将携带His标签的PDZD8-IDR锚定于膜表面（图二F和G）。结果观察到，即使在低于发生整体相分离所需阈值饱和浓度的条件下，PDZD8-IDR仍能在膜界面形成浓缩斑点（图二H和I），表明在细胞内的细胞器接触位点可能发生膜预润湿以及PDZD8密度转变。

图二 PDZD8-IDR在体外发生LLPS[9]

进一步探究PDZD8-IDR能否在活细胞内促进凝聚体形成。利用光激活的optoDroplets系统[12]，拟南芥隐花色素2（Cry2）的E490G突变体（Cry2olig）在蓝光刺激下发生寡聚化，当与诱导相分离的IDR融合时，可触发凝聚体形成[13]。在NIH3T3细胞中表达由PDZD8的TM、荧光蛋白mCherry和Cry2olig构成的融合蛋白（TM-Cry2olig，图三A）。即使在蓝光刺激几分钟后，TM-Cry2olig的分布也未发生显著变化（图三B）。相比之下，当将IDR^PDZD8插入TM与mCherry之间构建融合蛋白（TM-IDR^PDZD8-Cry2olig）后，蓝光刺激仅30秒即可形成凝聚体，其形态与内源性表达的PDZD8-HaloTag斑点相似（图三B）。关闭蓝光刺激后，这些TM-IDR^PDZD8-Cry2olig凝聚体逐渐解离，mCherry信号在30分钟内重新分布呈网状结构（图三B）。探究内源性PDZD8是否为TM- IDR^PDZD8诱导的光控凝聚体形成所必需，将TM-Cry2olig和TM- IDR^PDZD8-Cry2olig表达于经0.5 μM他莫昔芬处理48小时的Pdzd8^fl/fl::Cre^ERT2 MEF中。在内源性Pdzd8敲除细胞中，TM-Cry2olig在蓝光刺激后仅形成少量斑点，而TM-IDR^PDZD8-Cry2olig仍能在整个细胞中形成斑点（图三C和D）。以上结果表明，IDR^PDZD8足以促进LLPS，一旦含有该序列的蛋白发生寡聚化，即可在内质网膜上形成可逆的凝聚体。

图三 PDZD8的IDR足以驱动细胞内LLPS[9]

接下来，研究者探究PDZD8凝聚体是否具有液体样特性。在HeLa细胞中对HaloTag标记的内源性PDZD8进行1,000 Hz的单分子成像。低浓度JF549标记的Halo配体处理用于PDZD8单分子追踪，高浓度JF646标记的Halo配体则用于可视化PDZD8的整体部分（图四A-D）。JF646标记的内源性PDZD8易在斑点中聚集，并呈现内质网样定位（图四B-D）。基于JF646荧光信号，将直径≥500 nm且亮度至少为周围区域3倍的区域定义为PDZD8凝聚体（图四C）。对各凝聚体荧光强度的分析显示，每个凝聚体内源性PDZD8分子数量差异较大，介于4至44个之间（凝聚体占总簇数≥1%），中位数为18.8个（图四E和F）。重要的是，对JF549标记的内源性PDZD8进行单分子追踪显示，其沿内质网侧向扩散，但在凝聚体处出现侧向扩散的瞬时停滞（TALL，图四D）。将时间分数分为全时静止、TALL和运动状态时，凝聚体内部的运动分数显著降低（图四G）。与凝聚体外部相比，内源性PDZD8在凝聚体内部的TALL持续时间显著延长（图四H）。结合延时成像中观察到内源性PDZD8凝聚体的融合与分裂现象，这些结果表明PDZD8凝聚体是相分离的，并具有液体样特性。为探究PDZD8的IDR对凝聚体形成的贡献，在PDZD8-HaloTag的HeLa细胞中低水平表达SNAP标记的全长PDZD8（exo-FL）或缺失IDR的PDZD8（exo-ΔIDR），并用高浓度JF646偶联的Halo配体和低浓度TMR偶联的SNAP配体进行处理。exo-FL分子在凝聚体内积累的相对浓度与内源全长几乎相同，表明外源表达的PDZD8并未过度增加总PDZD8蛋白水平（图四F）。在相同条件下，exo-ΔIDR在凝聚体内的积累减少（图四F）。此外，尽管exo-FL在凝聚体处的全时静止和TALL的时间分数以及每次TALL事件的持续时间与内源全长相比无显著差异，但exo-ΔIDR在凝聚体处的运动性显著增强，其在凝聚体处的单次TALL持续时间显著缩短，达到与凝聚体外相当的水平（图四G和H）。以上结果表明，PDZD8以IDR依赖的方式发生相分离。

图四 超快单分子追踪揭示PDZD8在接触位点的动态凝聚行为[9]

随后，研究者探究在膜结合细胞器表面存在高亲和力相互作用的条件下，PDZD8的相分离是否仍能维持。利用Ni²⁺-NTA包被的磁珠和His标签蛋白建立了一套体外系统，在磁珠存在下重构His-mCherry-PDZD8-IDR凝聚体。尽管磁珠与His标签蛋白之间存在强的螯合相互作用，蛋白凝聚体仍然在磁珠表面得以维持（图五A），而His-mCherry未形成任何生物分子凝聚体，仅均匀包被在磁珠表面。生物分子凝聚体可在其界面处积聚电势，从而调节对脂质膜的润湿性[14]。为研究PDZD8凝聚体与膜表面之间的相互作用，将mCherry-PDZD8-IDR凝聚体与巨型单层囊泡（GUV）共孵育，进行共聚焦显微镜成像，定量蛋白凝聚体对囊泡的润湿程度，计算凝聚体与脂质双层之间的接触线比例（图五B和C）。结果显示，PDZD8-IDR凝聚体易于与GUV相互作用（图五C和D）。PDZD8-IDR在生理pH下带有高度负电荷，进一步在膜中引入负电荷，发现与中性电荷的脂质表面相比，生物分子凝聚体对带负电表面的排斥作用更强（图五D），表明润湿过程由静电相互作用所驱动。此外，在更高离子强度下润湿现象更为显著（图五E）。PDZD8已被报道调控胞质钙浓度[6]，研究者还研究了钙离子的影响，发现PDZD8-IDR凝聚体在钙离子存在下对带负电脂质表面的润湿程度显著高于中性电荷囊泡（图五F）。以上数据表明，PDZD8凝聚体以电荷和钙离子依赖的方式高效润湿脂质双分子层。

图五 PDZD8-IDR 凝聚体易于润湿接触的脂质表面[9]

最后，研究者探究PDZD8及其IDR是否为细胞内形成MERCS所必需。构建了三种质粒，全长PDZD8、缺失IDR的PDZD8（ΔIDR）、以及将富含脯氨酸和赖氨酸的PDZD8 IDR序列替换为FUS蛋白IDR，后者高度富含甘氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸和丝氨酸（图六A）。在Pdzd8^fl/fl::Cre^ERT2 MEF细胞中分组测试，发现Pdzd8 KO后，单位线粒体周长上的MERCS长度显著减少，表达全长PDZD8可挽救这一减少，而表达PDZD8 ΔIDR挽救效果显著减弱（图六B和C）。在MEF细胞分组测试，发现过表达全长PDZD8使单位线粒体周长上的MERCS长度增加了29.9%，而过表达ΔIDR则未能诱导MERCS形成，过表达PDZD8 IDR^FUS与全长PDZD8结果相似（图六D和E）。以上结果表明，PDZD8在细胞器膜表面的凝聚能力对于MERCS的形成是必需的。

图六 PDZD8的IDR凝聚能力是MERCS形成所必需的[9]

综上所述，该研究发现定位于内质网的PDZD8蛋白能够通过内在无序区域（IDR）发生相分离，在膜接触位点（MCS）形成凝聚体，帮助稳定细胞器间的膜接触面。这种由液-液相分离介导的凝聚体以电荷依赖性方式润湿脂质膜，其润湿程度可受膜的脂质组成、环境离子电荷以及钙浓度变化的精细调控。该研究为理解细胞如何组织膜接触位点提供了全新视角，表明细胞不仅依赖刚性的蛋白质“铆钉”来连接各种细胞器，还能通过IDR驱动的相分离，形成动态、可调节的“液态胶水分子”来组织膜接触位点，为研究无膜细胞器与膜结合细胞器之间的偶联提供了新的思路。

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