技术分享：转录因子直接竞争错配修复驱动DNA突变
尽管真核DNA复制的保真度极高，但在每个复制周期中仍会发生核苷酸的错误掺入，从而产生突变，驱动遗传疾病的发生和基因组进化。人类基因组的突变率差异很大，范围从横跨百万碱基如晚期复制区的高突变率，到单个核苷酸如CpG背景下的C>T高突变率[1]。介于这两种极端之间，转录因子（TF）的蛋白结合调控位点在体细胞中的突变也惊人地丰富。这种高频突变模式涉及多种因素和癌症类型。黑色素瘤细胞的基因组数据分析显示，TF结合位点（TFBS）的突变率增加和DNA修复减少具有相关性[2]，表明TF可能通过直接竞争修复来增加突变，但这仅适用于紫外线诱导引起的大量损伤，其修复依赖于核苷酸切除修复途径。相比之下，大约三分之二的癌症突变来源于复制错误，即没能通过错配修复（MMR）途径去除而留下的错配突变。因此，尚不清楚体细胞突变在多种癌症类型的TFBS中为何如此普遍。有研究证明，一系列结构域家族的TF蛋白表现出与DNA错配损伤的高亲和力结合[3]，提示TF的直接结合可能干扰了错配修复的识别与进行，导致体细胞突变的增加。在真核生物中，MutSα（MSH2和MSH6蛋白的异二聚体复合物）是识别DNA复制产生的错配并启动MMR修复的主要功能酶。因此，充分探究TF结合、MutSα识别与修复、DNA突变产生三者之间的关联，将使人们更广泛地理解遗传变异和基因组演化的突变机制。
2025年7月，Cell期刊在线报道了一项研究，发现转录因子（TF）与真核错配修复（MMR）的主要酶MutSα直接竞争，快速识别并结合DNA错配，从而干扰MMR修复，导致DNA突变产生（图一）。使用酵母遗传分析量化TF结合位点的突变积累，TF与MutSα竞争导致细胞中TF结合位点的突变增加，证明了这种TF诱导的突变机制。这一发现也存在于人类癌症细胞，由MYC结合错配引起的突变在MMR功能正常的细胞中增多，TF与MMR系统竞争是癌症中TF结合位点体细胞高频突变的关键决定因素。这种竞争在不同家族的MutSα同源物和TF中普遍存在。该研究揭示了一种新的TF诱导的突变机制，对研究TF结合位点罕见遗传变异疾病和调控基因组DNA演化具有重要意义[4]。
图一 转录因子与错配修复竞争诱导DNA突变[4]
之前研究证明，TF蛋白表现出与DNA错配损伤的高亲和力结合[3]。然而，由于目前没有可用的MutSα-TF竞争数据，因此尚不清楚这种结合是否足够强到竞争MutSα识别DNA错配。为此，研究者使用之前开发的饱和错配结合分析（SaMBA）[3]技术来定量测量MutSα单独或与TF竞争时结合数千个含有错配DNA序列的情况。选择酿酒酵母TF Cbf1作为研究对象，基于两个14 bp的序列设计错配DNA文库：一个包含高亲和力位点TCACGTGA的Cbf1靶序列[5]，和一个具有相同核苷酸组成但预计不会被Cbf1结合的杂乱位点（SS，图二A）。对于这两个序列，计算生成所选位点及其直接侧翼的所有可能错配。然后在高密度DNA芯片上从头合成DNA分子，作为单链探针，自杂交形成互补位点和所有可能的单错配变体（图二A和B）。将双链芯片与重组全长MutSα、Cbf1或MutSα和Cbf1以1:2的比例孵育，以匹配它们在酵母细胞中的相对丰度。根据芯片上每个DNA点的蛋白质荧光（MutSα）或抗体荧光（Cbf1）定量每种蛋白质的结合。正如预期，与基因组靶标类似，Cbf1与所选结合位点（TFBS）结合强烈，而与杂乱位点（SS）的结合在随机位点范围内（图二C）。杂乱位点的错配与Cbf1结合较差，而结合位点的错配显示出广泛的结合亲和力，其中大多数在基因组靶标范围内（图二D）。对MutSα的高通量结合数据表明，C-C错配的识别率很低，T-G错配具有很高的亲和力结合（图二E）。此外，发现大多数错配表现出广泛的MutSα结合亲和力，具体取决于序列背景。数据显示了显著的可重复性（图二F）、与独立结合亲和力数据[6]的高度相关性（图二G）。
图二 转录因子Cbf1与MutSα竞争结合DNA 错配[4]
比较Cbf1存在或不存在时的MutSα-DNA结合水平，结果显示出一种强烈的竞争性结合模式（图二H）。在杂乱位点引入的错配中，仅观察到Cbf1对MutSα结合的适度和非特异性影响（图二H，右），这与TF对这些探针的低亲和力相一致（图二D）。相比之下，在Cbf1结合位点引入的错配中，观察到在Cbf1存在的情况下MutSα结合显著减少，竞争效应的大小（与对角线的距离）在错配探针之间差异很大（图二H，左），并与Cbf1对错配序列的结合亲和力相关（R2=0.859；图二I）。此外，使用从SaMBA测量中得出的Cbf1和MutSα结合亲和力数据（图二G），发现Cbf1和MutSα之间直接竞争的简单生物物理模型：Cbf1导致MutSα识别错配的减少（图二J）。以上结果表明，Cbf1结合对MutSα识别错配产生了广泛影响，MutSα不能有效识别TF结合的DNA错配。
为了测量Cbf1错配结合对活细胞突变形成的影响，研究者采用LYS2逆转试验来测量酵母中的突变[7]。LYS2是酿酒酵母的一个非必需基因，它包含一个约150 bp的区域，被称为逆转窗口，该区域在功能上是不必要的，常被用于研究插入的异源DNA序列的诱变特性。研究者在LYS2逆转窗口插入了一个59 bp的DNA片段，该片段包含Cbf1结合位点或者杂乱位点，插入位点使TGA三联体充当过早的终止密码子（图三A）。分别将这些菌株称为“TFBS菌株”和“SS菌株”。为了防止插入位点形成核小体，从而促进Cbf1的直接结合，设计了DNA片段使结合位点和杂乱位点两侧都有刚性Poly (dA:dT)，在基因组中产生无核小体区域[8]。使用染色质免疫沉淀和定量实时PCR（ChIP-qPCR）进行验证，证实Cbf1能有效结合插入LYS2逆转窗口的TFBS位点，但不能结合杂乱位点。尽管LYS2基因在全培养基中不是必需的，但对于赖氨酸缺乏培养基中的存活至关重要。于是，在细胞积累72小时的自发突变后，将细胞转移到赖氨酸缺乏的培养基中，以选择LYS2+细胞。这些细胞成功将逆转窗口中的TGA转变为有义密码子，从而获得功能性LYS2蛋白。这种自发突变可能通过16种可能性错配引入，但不同错配对Cbf1具有不同的结合亲和力、不同水平的MutSα-Cbf1竞争，从而对MMR产生不同的影响。假设在Cbf1结合位点的TGA三联体第一个位置发生T-G错配，Cbf1以高亲和力结合并显著降低MutSα结合，导致细胞的错配识别和修复效率低下，那么预计相应突变（TGA>CGA）的发生率会增加，这是一种Cbf1促进突变（图三A）。相比之下，Cbf1对同一位置的T-C错配结合较差，预计Cbf1不会干扰这种错配的修复，导致相应突变的发生率较低（TGA>GGA），这是一种Cbf1中性突变（图三A）。如果Cbf1与错配的结合影响了MutSα结合和MMR进程，那么预计Cbf1促进突变的发生率将明显高于Cbf1中性突变（图三A）。为排除影响细胞局部突变率的其他影响，使用SS菌株作为对照（图三A右侧）。
图三 TF结合DNA错配导致活细胞突变增加[4]
研究者测量了TFBS菌株和SS菌株的LYS2+逆转率，其中Cbf1表达量要么以内源性水平存在（WT），要么是过表达（OX）。通过对每种菌株至少40个回复突变进行测序，确定了TGA过早终止密码子的突变。比较了WT和过表达Cbf1的菌株突变情况，将突变类型分为4种Cbf1促进突变和4种Cbf1中性突变。在过表达Cbf1后，Cbf1促进突变增加了约6倍，而同一TFBS菌株Cbf1中性突变的增加为1.3倍（图三B，蓝色）。在杂乱位点上，两组之间没有观察到显著差异（图三B，灰色）。此外，在结合位点的Cbf1促进突变率明显高于杂乱位点的促进突变率（图三B）。为进一步证实Cbf1促进突变率的增加是由于Cbf1结合DNA复制过程产生错配所造成的，先将pol3-5DV等位基因引入TFBS和SS酵母菌株中，以禁用复制性DNA聚合酶Polδ的校对能力，已知这会增加Polδ错误掺入率并导致强烈的突变表型。正如预期，TFBS和SS菌株的总体突变率都有所增加，其中TFBS菌株中Cbf1促进突变率增加了92倍，而SS菌株的Cbf1促进突变率和中性突变率之间没有显著差异（图三C），表明pol3-5DV菌株也表现出由于TF强烈结合错配引起的突变大幅增多。此外，通过缺失MSH2来消除MMR系统，MSH2是编码MutSα酶两种成分之一的基因。在MMR缺陷（msh2Δ）细胞中，Cbf1促进突变和中性突变发生率之间，以及TFBS和SS菌株之间都没有观察到显著差异（图三D），表明这一过程确实需要MMR系统来增强TF结合错配引起的突变。
为了确定上述酵母中的TF诱导突变是否延展到人类细胞，研究者进一步分析了MYC结合位点的癌症体细胞突变数据。MYC是一种强效癌蛋白TF，在人类癌症中表现出异常过度表达和广泛的基因组占有率[9]。使用SaMBA技术进行MYC-MutSα竞争实验，基于一个MYC结合位点和具有相同核苷酸组成的相应杂乱位点，计算所有可能的错配变体，并在高密度芯片上合成了错配DNA文库，最后与MutSα单独或与MYC竞争性孵育，孵育浓度模拟人类细胞中的相对表达水平（图四A）。结果显示，在MYC结合位点的DNA错配上，MYC与MutSα存在有效竞争，但在杂乱位点上则没有（图四B），TFBS上的MYC促进突变显著增加，且MYC存在时MutSα结合的减少与MYC结合能力相关（R2=0.89，图四C和D）。考虑出现在人类基因组非编码区的所有假定MYC结合位点，不仅包括规范的E-box位点CACGTG，还包括E-box样变体CACATG、CACGCG和CACGAG。使用癌症体细胞突变数据集[10]，来自10例具有微卫星不稳定性（MSI）和90例具有微卫星稳定性（MSS）表型的肿瘤。汇编了非编码人类基因组中这些假定MYC结合位点的所有突变。已包含足够多的MSI（一种由MMR缺陷引起的高变表型）样本，可以分析MMR缺陷细胞中MYC位点的突变率。结果显示，与对照位点相比，MYC结合位点的促进突变率显著增加，这种增加趋势仅存在于MSS样本中，而不存在于MMR缺陷的MSI样本中（图四E）。对于MYC中性突变，都没有增加趋势（图四F和G）。以上结果表明，MYC与MutSα在识别特定复制错误方面的竞争，确实会导致MYC结合位点的突变增加。
图四 MYC-MutSα竞争与MYC结合位点的较高突变率相关[4]
上述测试的酵母Cbf1和人MYC蛋白都是真核TF bHLH家族成员。研究者还对另外三种人源MAX、CREB1和EGR1进行了TF-MutSα竞争实验，发现它们都对MutSα错配识别产生了强烈的影响。TF与MutSα竞争的普遍性也延伸到MutSα同源物，如重组人MutSα。以上结果表明，这种TF与MutSα竞争可能在不同结构域家族TF之间以及不同生物体的MutSα蛋白之间广泛存在。
综上所述，研究者利用体外SaMBA技术发现转录因子（TF）与DNA错配的结合具有高亲和力，可以有效竞争真核错配修复（MMR）主要酶MutSα对错配的识别。利用开发的酵母诱变系统监测活细胞中TF相关突变的积累，发现这种直接竞争干扰了MMR进程，增加了TF结合位点上复制错误引起的突变。这一现象也存在于人类癌症细胞，表现为由MYC结合错配引起的突变在MMR正常功能细胞中的增多，表明TF与MMR竞争是癌症中TF结合位点出现体细胞高频突变的关键决定因素。该研究为TF结合位点出现罕见遗传变异提供了一种全新视角的分子机制，对研究疾病发生和基因组演化的DNA突变调控具有重要意义。
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