技术分享：线粒体逆行信号导致代谢组织的细胞身份丢失与去成熟化

线粒体对真核生物的细胞能量调控至关重要，线粒体缺陷常与代谢疾病如2型糖尿病（T2D）的发展密切相关[1]。T2D患者的骨骼肌线粒体呼吸能力和线粒体DNA（mtDNA）含量降低，在胰岛素的刺激下，线粒体产生较少的ATP[2]。T2D患者的肝脏线粒体解偶联和质子泄漏，导致线粒体呼吸作用、ATP合成与周转的减少[3]。线粒体功能障碍是T2D的一种广谱的统一机制，已在心肌、血管内皮、脂肪组织、中枢和周围神经系统中都观察到线粒体的缺陷[4]。近期研究发现，T2D患者的多种组织中存在终末细胞身份丢失的现象。过去认为β细胞数量的维持取决于其增殖与凋亡的平衡，但现已证实β细胞的去分化是驱动T2D中β细胞功能衰竭的关键因素。去分化的β细胞不仅丢失了成熟β细胞的关键特征因子，还可能获得了内分泌祖细胞的标志物，从而异常表达其他胰岛细胞的激素[5]。在T2D病程中，其他组织也能观察到分化功能受损的现象[6]。

这种T2D的线粒体结构、基因表达和能量代谢的缺陷，可能源于线粒体质量控制受损或线粒体生命周期的调控异常。线粒体的基因组完整性、生物合成、动力学和周转受线粒体自噬的严格调控[7]。线粒体逆行信号是指由线粒体向细胞核传递的信号通路，在正常生理和病理条件下影响着多种细胞及机体的活动。尽管线粒体功能障碍在T2D疾病中具有核心作用，但尚不明确线粒体质量控制的异常是否激活线粒体逆行信号通路，直接导致代谢组织的去成熟化，进而发展成代谢紊乱。

2025年4月，Science期刊报道一项研究，发现线粒体质量控制的异常能够引发电子传递链-氧化磷酸化（ETC-OXPHOS）缺陷，触发线粒体逆行信号，激活线粒体整合应激反应（mtISR），引发染色质重塑，促进细胞去成熟化而不是凋亡，最终造成代谢功能障碍。具体而言，研究者利用线粒体自噬缺陷、线粒体DNA耗竭和融合缺陷的三种小鼠，证实线粒体质量控制的异常会激活mtISR，损害β细胞、肝细胞和棕色脂肪细胞的细胞身份和成熟度。药理学阻断mtISR可恢复β细胞的质量和身份。该研究强调了线粒体质量调控在维持代谢组织细胞特性和功能成熟方面的核心作用，为代谢紊乱的发病机制提供了更深层次的理解，提示靶向线粒体逆行信号传导在预防或治疗代谢紊乱方面具有广阔前景[8]。

首先，研究者探究2型糖尿病（T2D）患者的线粒体质量控制受损情况。与非糖尿病人群相比，T2D患者的胰岛组织线粒体DNA（mtDNA）含量显著降低（图一A），β细胞的13种线粒体编码RNA（mtRNA）有11种表达下调（图一B），且这种下降具有β细胞特异性。通过流式细胞术评估线粒体自噬情况。在非糖尿病患者的β细胞中，钾离子载体缬氨霉素诱导了预期的线粒体自噬增强，而T2D的β细胞线粒体自噬显著减弱（图一C），在T2D的非β细胞中未观察到线粒体自噬缺陷。接着，研究线粒体质量控制受损是否足以导致β细胞功能衰竭。CLEC16A是维持线粒体呼吸、胰岛素分泌和血糖稳态的关键自噬调控因子。研究者构建β细胞特异性CLEC16A缺失小鼠（Clec16a^f/f；Ins1-Cre，简称β-Clec16a^KO），和对照小鼠分别常规饮食（RFD）或高脂饮食（HFD）喂养12周。RFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠出现葡萄糖耐量受损，且在高脂饮食诱导肥胖（DIO）后进一步加剧（图一D）。与此同时，β-Clec16a^KO小鼠的β细胞数量减少，且在DIO后β细胞数量也无法代偿性增加（图一E）。检测β细胞增殖和凋亡标志物，2组小鼠未见显著差异（图一F和G），表明β细胞数量的减少可能还存在其他机制的参与。

图一 T2D β细胞的线粒体质量控制受损导致β细胞不成熟[8]

Tfam负责维持线粒体基因组完整性、mtDNA拷贝数及mtRNA转录。研究者构建了β-Tfam^KO小鼠，靶向敲除Tfam，使β细胞特异性mtDNA耗竭。与β-Clec16a^KO小鼠相似，β-Tfam^KO小鼠随年龄增长表现出葡萄糖耐量受损，葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能下降（图一H和I）。β-Tfam^KO小鼠在8周和12周时β细胞增殖显著增加（图一J），但β细胞凋亡在8周时无变化，12周时轻微增加（图一K）。以上数据表明，2型糖尿病β细胞存在线粒体质量控制缺陷，后者是维持β细胞数量与功能的关键。

随后，研究者探究上述两种线粒体质量控制干预模型表型相似的共同机制。对RFD和HFD喂养的β-Clec16a^KO和β-Tfam^KO小鼠及其对照组的胰岛进行RNA测序。将结果与之前验证的β细胞成熟和不成熟基因数据集相比较，发现RFD和HFD喂养的β-Clec16a^KO和β-Tfam^KO小鼠胰岛中不成熟基因上调和成熟基因下调（图一L和M）。基因集富集分析（GSEA）证实，Clec16a或Tfam缺失小鼠中上调的基因显著富集β细胞未成熟标志物（图一N）。此外，两种模型的核心β细胞成熟或身份标志物（Ins2、Ucn3、Glut2、MafA）表达降低，未成熟标志物表达升高（图一O）。胰腺组织切片免疫染色显示，RFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠中检测到去分化标志物ALDH1A3，该标志物不存在于终末分化的β细胞，但已在T2D胰岛中发现[5]，且HFD喂养后表达进一步增加（图一P）。β-Tfam^KO小鼠的β细胞同样出现ALDH1A3上调（图一P）。还观察到Clec16a、Tfam缺陷β细胞中另一去分化标志物CD81的表达升高（图一P）。免疫染色和蛋白质印迹分析发现，与对照组相比，两组模型中β细胞成熟标志物GLUT2和UCN3均显著减少（图一Q和R）。进一步采用遗传谱系示踪技术验证两组模型小鼠中β细胞身份的丢失。将β-Clec16a^KO和β-Tfam^KO小鼠与ROSA26-lox-STOP-lox-tdTomato报告小鼠杂交[9]，β细胞身份丢失将导致胰岛素阴性且tdTomato阳性的细胞出现。RFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠与对照组间未发现tdTomato谱系分配的差异，而HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠的胰岛素阴性/tdTomato阳性细胞显著增加（图一S）。Tfam缺失小鼠同样表现出胰岛素阴性/tdTomato阳性细胞的急剧增多（图一S），提示mtDNA耗竭对β细胞身份维持具有深远影响。以上数据表明，线粒体质量控制受损会诱导β细胞未成熟标志物表达，导致β细胞身份丢失。

研究者推测线粒体质量控制受损可能通过激活保守的线粒体逆行信号通路，引发转录水平改变，从而诱导β细胞去分化或未成熟状态。于是，对线粒体自噬缺陷（β-Clec16a^KO）、mtDNA耗竭（β-Tfam^KO）及线粒体融合障碍（β-Mfn1/2^DKO）小鼠的胰岛RNA-seq差异表达基因进行对比分析。发现三种模型共有74个上调基因和28个下调基因重叠（图二A）。通过STRING对102个共同差异表达基因进行分析，发现β细胞成熟相关关键因子（Ins2、Ucn3、MafA及编码GLUT2的Slc2a2）与整合应激反应（ISR）通路基因（Trib3、Ddit3、Atf3、Fgf21、Cebpβ、Gdf15）存在显著相互作用网络（图二B）。线粒体逆行信号的一种作用机制是通过ISR实现，该通路能将线粒体或内质网（ER）损伤响应整合为统一信号途径，其激活依赖于翻译起始因子EIF2α的磷酸化，进而稳定ATF4蛋白以启动下游转录。RFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠中观察到经典ISR靶基因的上调，且HFD喂养后该效应进一步增强（图二C），且在β-Tfam^KO和β-Mfn1/2^DKO胰岛中同样显示ISR靶基因上调（图二D）。三种模型胰岛中EIF2α磷酸化水平及ATF4蛋白含量均增加（图二E和F）。但未观察到内质网应激现象，ER分子伴侣Bip表达无升高（图二G）。

图二 线粒体质量控制缺失激活胰岛的整合应激反应[8]

为探究线粒体质量控制缺陷是否在人类β细胞中同样引发ISR及成熟度丢失，研究者通过类胰岛重组技术构建TFAM缺陷的EndoC-βH3人β细胞系及原代人胰岛模型。简言之，将分离的人胰岛细胞用靶向TFAM的shRNA腺病毒颗粒转导后，重聚形成类胰岛。在EndoC-βH3细胞和人源类胰岛中均证实TFAM被高效敲降，且mtRNA表达减少，这与TFAM功能受损的特征一致（图二H和I）。与小鼠模型观察结果相似，TFAM缺陷会激活人β细胞及人源类胰岛的线粒体ISR通路，表现为EIF2α磷酸化及ATF4蛋白稳定，ISR转录靶标CEBPβ、CHOP、GDF15和FGF21的表达增多，以及BIP表达未发生改变（图二J和K）。此外，β细胞成熟标志物表达下降（图二L）。以上数据表明，线粒体质量控制缺陷在小鼠和人类胰岛中均诱导了ISR激活及β细胞去成熟化。

接下来，研究者联合应用单细胞核RNA测序（snRNA-seq）和单细胞核转座酶可及性染色质测序（snATAC-seq），解析线粒体质量控制缺失后，β细胞中由线粒体逆行信号介导的转录组变化。UMAP显示，HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠β细胞与对照组之间存在明显的异质性（图三A）。snATAC-seq检测到25,016个特异性顺式调控元件的染色质可及性峰，与对照组相比缺失了3,567个峰（图三B）。这些变化包括，Ins2基因座多个位点的染色质可及性丧失，Atf3和Gdf15基因座的可及性增加（图三C）。利用HOMER软件进行的转录因子结合位点[10]分析显示，Clec16a缺陷β细胞中ISR相关转录因子，尤其是bZIP家族成员ATF4、ATF3和CHOP的结合基序显著富集（图三D和E）。同时，与T2D β细胞去分化相关的转录因子BACH2[11]，其结合位点也在Clec16a缺陷β细胞中增加。此外，维持β细胞成熟状态、身份和功能的关键转录因子，如β细胞特异性转录因子及成熟调控因子NEUROD1[12]的结合位点则显著减少。以上数据表明，线粒体逆行信号通过改变染色质可及性，促进ISR转录激活并导致β细胞身份与成熟状态丢失。

图三 线粒体质量控制缺失诱导染色质重塑[8]

接下来，研究者探究线粒体质量控制缺陷是否在其他代谢组织也引发类似的去成熟化和功能障碍。HFD喂养12周后，向Mfn1^f/f/Mfn2^f/f和Tfam^f/f小鼠腹腔注射AAV8-Tbg^cre，构建肝细胞特异性缺失Mfn1/2或Tfam的小鼠（L-Mfn1/2^DKO和L-Tfam^KO，图四A-C）。两种小鼠均表现为mtDNA含量降低，OXPHOS亚基表达改变，但线粒体质量未见明显减少（图四D-H）。肝功能损伤明显，表现为L-Tfam^KO小鼠血清ALT和LDH升高，L-Mfn1/2^DKO小鼠中血清胆固醇降低，二者肝糖原减少（图四I-L）。RNA-seq分析显示，与β细胞类似，L-Mfn1/2^DKO和L-Tfam^KO小鼠均表现出典型ISR靶基因的上调，但未伴随内质网应激标志物Bip的表达升高（图四M）。将RNA-seq数据与肝细胞终末分化及发育关键标志物的数据库进行比对，发现成熟肝细胞标志物，如细胞色素P450活性和胆红素葡萄糖醛酸化的相关基因表达下降，未成熟肝细胞标志物如甲胎蛋白Afp、Top2a和Psat1等表达显著增加（图四N和O）。实验证实两组小鼠ISR通路激活，表现为EIF2α磷酸化和ATF4蛋白水平升高（图四P），成熟肝细胞蛋白（CYP2E1、MUP-3）表达降低，未成熟蛋白（AFP、TOP2A、PSAT-1）增加（图四Q和R）。由于线粒体对棕色脂肪组织（BAT）具有关键作用，研究者进一步检测心磷脂合成酶（Crls1）缺陷小鼠终末分化标志基因表达及ISR的变化。Crls1是线粒体心磷脂生物合成的关键酶，其通过心磷脂依赖性线粒体自噬和mtDNA含量维持来调控线粒体质量控制[13]。研究者构建脂肪细胞特异性Crls1敲除小鼠（AdCKO），在BAT中发现成熟标志基因显著下调，如Ppargc1α和Ucp1，ISR转录靶标基因激活（图四S）。以上数据表明，线粒体质量控制通过抑制代谢组织中线粒体逆行信号来维持终末细胞的身份。

图四 线粒体质量控制受损诱导肝细胞和棕色脂肪细胞的ISR激活及其去成熟化[8]

上述多组织研究结果提示，线粒体质量控制缺陷可能通过激活ISR直接导致终末细胞去成熟化或身份丢失。最后，为验证ISR对β细胞成熟维持的关键作用，研究者对HFD的β-Clec16a^KO小鼠的离体胰岛进行24小时ISR药理抑制剂ISRIB[14]处理，发现显著降低了ISR转录靶标Cebpβ和Trib3的表达（图五A和B），恢复了β-Clec16a^KO胰岛中Ucn3的表达，并降低了ALDH1A3的表达（图五C和D），提示β细胞成熟度改善。将β-Clec16a^KO小鼠与mt-Keima线粒体自噬报告基因品系杂交，发现ISRIB处理并未改善Clec16a缺陷导致的线粒体自噬缺陷（图五E），表明其作用机制是通过抑制ISR介导的逆向信号通路，而非增强线粒体质量控制。进一步在体内进行验证，对喂食HFD的β-Clec16a^KO小鼠每天腹腔注射ISRIB 4周（图五F）。发现抑制ISR可防止HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠的β细胞质量损失并改善葡萄糖耐受不良，而组间胰岛素敏感性保持不变（图五G-I）。ISRIB处理还降低了HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠中ALDH1A3的表达，并增加了GLUT2或UCN3阳性表达β细胞的比例，这与β细胞成熟度和身份的恢复相一致（图五J-O）。以上数据表明，阻断ISR介导的逆行信号通路可恢复β细胞数量及成熟度。

图五 抑制线粒体逆行信号可恢复β细胞的数量及成熟状态[8]

综上所述，研究者利用三种线粒体质量控制缺陷小鼠模型的RNA测序数据发现共有的逆行信号响应，即线粒体综合应激反应（mtISR）的激活，诱导了β细胞、肝细胞和棕色脂肪细胞染色质可及性和基因表达的强烈变化，导致了细胞去分化和不成熟，从而引发多种代谢组织功能障碍。终末细胞的身份改变具有可逆性，通过抑制mtISR可恢复细胞的成熟状态、数量及其功能。该研究确立了线粒体质量控制-mtISR轴作为代谢组织细胞命运调控的普适性枢纽，为糖尿病、非酒精性脂肪肝等代谢疾病的治疗提供了新的靶点。

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参考文献

1. Flannick J, Mercader JM, Fuchsberger C, Udler MS, Mahajan A, Wessel J, Teslovich TM, Caulkins L, Koesterer R, Barajas-Olmos F et al: Exome sequencing of 20,791 cases of type 2 diabetes and 24,440 controls. Nature 2019, 570(7759):71-76.

2. Phielix E, Schrauwen-Hinderling VB, Mensink M, Lenaers E, Meex R, Hoeks J, Kooi ME, Moonen-Kornips E, Sels JP, Hesselink MK et al: Lower intrinsic ADP-stimulated mitochondrial respiration underlies in vivo mitochondrial dysfunction in muscle of male type 2 diabetic patients. Diabetes 2008, 57(11):2943-2949.

3. Schmid AI, Szendroedi J, Chmelik M, Krssák M, Moser E, Roden M: Liver ATP synthesis is lower and relates to insulin sensitivity in patients with type 2 diabetes. Diabetes care 2011, 34(2):448-453.

4. Pinti MV, Fink GK, Hathaway QA, Durr AJ, Kunovac A, Hollander JM: Mitochondrial dysfunction in type 2 diabetes mellitus: an organ-based analysis. American journal of physiology Endocrinology and metabolism 2019, 316(2):E268-e285.

5. Cinti F, Bouchi R, Kim-Muller JY, Ohmura Y, Sandoval PR, Masini M, Marselli L, Suleiman M, Ratner LE, Marchetti P et al: Evidence of β-Cell Dedifferentiation in Human Type 2 Diabetes. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 2016, 101(3):1044-1054.

6. Kahn CR, Wang G, Lee KY: Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. The Journal of clinical investigation 2019, 129(10):3990-4000.

7. Kaufman BA, Li C, Soleimanpour SA: Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular aspects of medicine 2015, 42:91-104.

8. Walker EM, Pearson GL, Lawlor N, Stendahl AM, Lietzke A, Sidarala V, Zhu J, Stromer T, Reck EC, Li J et al: Retrograde mitochondrial signaling governs the identity and maturity of metabolic tissues. Science 2025, 388(6743):eadf2034.

9. Madisen L, Zwingman TA, Sunkin SM, Oh SW, Zariwala HA, Gu H, Ng LL, Palmiter RD, Hawrylycz MJ, Jones AR et al: A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature neuroscience 2010, 13(1):133-140.

10. Heinz S, Benner C, Spann N, Bertolino E, Lin YC, Laslo P, Cheng JX, Murre C, Singh H, Glass CK: Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular cell 2010, 38(4):576-589.

11. Son J, Ding H, Farb TB, Efanov AM, Sun J, Gore JL, Syed SK, Lei Z, Wang Q, Accili D et al: BACH2 inhibition reverses β cell failure in type 2 diabetes models. The Journal of clinical investigation 2021, 131(24).

12. Gu C, Stein GH, Pan N, Goebbels S, Hörnberg H, Nave KA, Herrera P, White P, Kaestner KH, Sussel L et al: Pancreatic beta cells require NeuroD to achieve and maintain functional maturity. Cell metabolism 2010, 11(4):298-310.

13. Terešak P, Lapao A, Subic N, Boya P, Elazar Z, Simonsen A: Regulation of PRKN-independent mitophagy. Autophagy 2022, 18(1):24-39.

14. Halliday M, Radford H, Sekine Y, Moreno J, Verity N, le Quesne J, Ortori CA, Barrett DA, Fromont C, Fischer PM et al: Partial restoration of protein synthesis rates by the small molecule ISRIB prevents neurodegeneration without pancreatic toxicity. Cell death & disease 2015, 6(3):e1672.