技术分享：新型超稳定单体红色荧光蛋白mScarlet3-H
利用荧光蛋白（FP）可以对细胞、组织和模式生物中的生物分子进行超高时空分辨率可视化、跟踪和定量。随着显微镜方法和技术的不断进步，对高性能荧光蛋白产生了巨大的需求，其物理化学稳定性在显微镜技术中起着至关重要的作用。样品成像前往往经历苛刻的处理步骤。例如，使用光电关联显微镜（CLEM）时，需要用强氧化剂四氧化锇（OsO4）处理样品，该步骤会导致荧光蛋白的荧光信号显著淬灭[1]。尽管已经开发了一些耐OsO4的荧光蛋白，但它们的荧光保留率通常不超过20%[2]。此外，由于主流荧光蛋白的热稳定性有限，组织透明化技术需要在室温或低于37℃下进行，导致通常需要一到数周的时间才能达到最佳透明度，限制了成像的效率[3]。而活细胞超分辨率成像技术则要求荧光蛋白具有较高的光稳定性，以实现长时程的活细胞成像。
最近，随着光稳定性最优的绿色荧光蛋白（GFP）StayGold及其单体变体的发展[4, 5]，长时程活细胞成像发生了彻底的变革。此外，化学稳定的“超折叠”黄色荧光蛋白（hfYFP）显著扩大了荧光蛋白在CLEM和膨胀成像中的适用性[2]。荧光蛋白正式进入一个新时代——“超稳定荧光蛋白”时代。与GFP和YFP相比，红色荧光蛋白（RFP）具有几个优点，特别是在较低的光毒性、自发荧光和光散射以及在较长波长下的最大组织穿透等方面[6]。因此，开发光稳定性的红色荧光蛋白仍然是生物领域的关键需求。
2025年4月，Nature Methods期刊在线报道了一项研究，开发了一种极其稳定的单体红色荧光蛋白mScarlet3-H，其激发光约为561 nm。mScarlet3-H对高温、离液条件和氧化环境具有显著的抵抗力, 能够对哺乳动物细胞的各种细胞器进行光电关联显微镜（CLEM）成像，也能通过三维结构光照明显微镜（3D-SIM）对线粒体融合和分裂进行长时程动态成像，还可用于双色活细胞受激发射损耗（STED）成像，具有高信噪比和强特异性。基于mScarlet3-H的热稳定性、耐OsO4等变性条件、超高光稳定性的多项优势，使其成为可耐受生物样本苛刻处理条件和长时程活细胞超分辨率成像的先进成像技术的理想候选荧光蛋白[7]。
为了开发高度稳定的红色荧光蛋白（RFP），研究者将目光转向一种单体RFP，mScarlet及其衍生物（图一a-d）。mScarlet具有高荧光亮度，而其衍生物mScarlet-H（单M164H突变）表现出更好的光稳定性，但亮度降低[8]。测定mScarlet-H的晶体结构（分辨率1.82 Å）显示，发色团的苯基部分与H164的侧链之间形成了直接的氢键（图一d）。基于mScarlet、mScarlet3和mScarlet-H的结构，分别在不同温度和pH水平下进行分子动力学模拟。结果显示，mScarlet3的热稳定性明显优于mScarlet和mScarlet-H，而mScarlet-H的化学稳定性明显高于mScarlet和mScarlet3，表明mScarlet-H和mScarlet3可能代表mScarlet家族中两种不同的进化途径。mScarlet3与mScarlet相比包含一系列的突变，但与mScarlet-H的不同之处仅在于M164H突变。于是研究者结合mScarlet3和mScarlet-H中的突变，特别是M163H突变（对应于mScarlet-H中的164位），将mScarlet3的热稳定性和高亮度与mScarlet-H的化学稳定性结合起来，构建了名为mScarlet3-H的RFP。相比其他突变体，只有携带163H的mScarlet3-H在电子显微镜（EM）下显示出优异的荧光保留能力。测定了mScarlet3-H的晶体结构（图一e，分辨率1.5 Å），证实存在与mScarlet-H类似的发色团-H163相互作用（图一d-h）。此外，观察到额外的水和mScarlet3-H发色团的咪唑啉酮环之间新形成的氢键（图一e）。
图一 mScarlet3及其衍生物的结构比较和mScarlet3-H的基本性质[7]
进一步表征mScarlet3-H的光谱和生化特性。mScarlet3-H的光谱特性与mScarlet-H相似（图一i），表现出高pH稳定性（图一j）和快速的发色团成熟（图一k），比mScarlet-H快2.8倍，半衰期为36分钟。凝胶过滤（图一l）和有组织平滑内质网（OSER）分析[9]证实，mScarlet3-H在溶液和细胞中都是真正的单体形式。使用不同的表达系统评估mScarlet3-H作为融合标签的性能。在COS-7细胞中瞬时表达mScarlet3-H融合蛋白后，使用共聚焦显微镜或SIM的合理化深度学习（rDLSIM）检查其定位。正如预期，mScarlet3-H正确标记了各种细胞成分，如微管（EMTB）、线粒体外膜（Tom20）、F-actin（Lifeact）、线粒体嵴（Phb2）、ER（Sec61β）和脂滴膜（Plin5）（图一m）。在烟草属植物细胞中表达mScarlet3-H，能有效靶向线粒体（IDH1）和ER（PVA11）（图一n）。为评估mScarlet3-H在体内应用的性能，向斑马鱼幼虫注射H2B-mScarlet3-H mRNA，成功地在大多数斑马鱼幼虫细胞中成像了H2B-mScarlet3-H细胞核（图一o）。此外，通过延时成像观察细胞的有丝分裂，能精确捕捉到细胞有丝分裂的不同阶段（图一p）。以上数据表明，mScarlet3-H作为单体RFP，在不同生物系统中都表现出高效的荧光性能。
接着，评估mScarlet3-H的锇酸抗性，将其与现有的mScarlet衍生蛋白和其他常用荧光蛋白进行比较。mScarlet3-H靶向细胞核，在固定、脱水和Epon包埋后对细胞进行1% OsO4处理。在100 nm厚的细胞切片上进行荧光成像（图二a）。mScarlet3-H的荧光强度的信噪比比任何其他测试的荧光蛋白至少高三倍（图二b）。评估mScarlet3-H在离液条件下的热稳定性和化学稳定性，都表现出卓越的稳定性，即使在90℃下也能保持约82.5%的荧光，至少是mScarlet3（41.7%）、mRuby3（37%）和mCherry2（27%）的两倍，其余的荧光蛋白在90℃加热后几乎被完全淬灭（图二c）。评估mScarlet3-H在固定细胞和体外的光稳定性，发现在0.9、17.65和33.95 W cm-2的不同光功率下，即使与FPbase数据库上具有强光稳定性的mScarlet-H相比，mScarlet3-H在固定细胞（图二d）和体外（图二e）都表现出优异的光稳定性 ，表明mScarlet3-H是最具有光稳定性的单体RFP。将mScarlet3-H靶向不同细胞器，瞬转质粒后进行eC-CLEM处理，可在超微结构上检测到其正确靶向线粒体嵴（图二f）、脂滴膜（图二g）、ER（图二h）、核膜（图二i）和细胞核（图二j），实现了高信噪比的光电关联成像。以上数据表明，mScarlet3-H是进行CLEM成像的荧光蛋白的最佳选择。
图二 荧光蛋白的稳定性比较以及mScarlet3-H标记不同细胞器[7]
组织透明化技术有利于大体积全器官样品的深度成像，但这是一个耗时的处理过程。基于mScarlet3-H具有高热稳定性和化学稳定性等内在特性，研究者推测即使在经历恶劣的透明化条件后，也能保留组织样本中的mScarlet3-H荧光。于是，在脱色、脱脂、脱水和透明化步骤中，将温度提高到60°C或70°C ，仅需1天就成功实现成年小鼠整个大脑的透明化和包埋（图三a）。 通过这种快速的TESOS（rTESOS）透明化程序，脑组织中表达的mScarlet3-H在包埋后保持高达68%的荧光强度。相比之下，tdTomato仅保留了9%的荧光，而EGFP、EYFP、mCherry、mScarlet、mScarlet-H和mScarlet3在rTESOS过程后荧光完全淬灭（图三b）。在70 °C时，mScarlet3-H的荧光与60°C时的结果相当。进一步评估mScarlet3-H在神经元定位和回路追踪中的适用性。在成年小鼠脑神经元中注射hSyn-Cre和DIO-CAG-mScarlet3-H AAV2/9。随后，小鼠大脑进行rTESOS透明、包埋、切片和共聚焦显微镜进行成像（图三c）。对大脑注射部位附近1.18 × 1.18 × 0.83 mm3的组织进行成像（图三d）。rTESOS中采用的包埋和切片策略确保组织内不同深度都能保持均匀的分辨率（图三e和f）。研究结果表明，mScarlet3-H在胞体（图三e1和f1）、树突（图三e2和f2）和轴突中均匀表达，实现了神经元重建和两个神经元的半自动脊柱识别（图三g和h）。以上结果表明，mScarlet3-H清晰有效地标记了完整的神经元形态，能够快速透明化组织，强调了其在绘制神经元回路图谱中的价值。
图三 mScarlet3-H的强大热稳定性可实现快速组织透明化[7]
与二维SIM相比，3D-SIM由于其独特的成像过程，对荧光探针的光稳定性提出了更严格的要求。于是，研究者探究mScarlet3-H在活细胞内高度动态亚细胞结构的长时程3D-SIM成像中的潜力。通过与细胞色素 c 氧化酶亚基8A（COX8A）串联重复融合，分别用mScarlet3-H、mScarlet-H、mScarlet、mScarlett3、tdTomato、TagRFP-T和mCherry标记线粒体，进行持续的3D-SIM活细胞成像，动态可视化线粒体。值得注意的是，mScarlet3-H在2 小时无间隔的连续成像中，光漂白最小（图四a和b），能够以100 nm分辨率追踪线粒体的融合和裂变（图四c）。在相同的成像设置下，mScarlet-H、mScarlet、mScarlet3、tdTomato、TagRFP-T和mCherry的荧光分别损失了30%、78%、75%、56%、21%和39%（图四b）。
图四 mScarlet3-H能够对不同细胞器进行长时程3D-SIM成像和STED成像[7]
STED通过激发光+环形损耗激光的精准叠加，物理抑制激发点外围的荧光发射，从而突破衍射极限，实现“缩小激发点”的超分辨成像[10]，这对荧光探针的光稳定性提出更高的要求。最后，研究者比较了mScarlet3-H和其他荧光蛋白在STED成像中的光稳定性。固定细胞中内质网和线粒体外膜的STED成像，进一步验证了mScarlet3-H的能力（图四d和f）。STED可清楚地检测到片状内质网中的纳米孔（图四d），这在常规显微镜下表现为薄片[11]。纳米孔的直径为168 ± 58 nm（图四e）。使用3D-STED清楚地检测到Tom20的中空分布（图四f和g）。进一步探索mScarlet3-H在双色STED成像中的优势，用mScarlet3-H靶向内质网，并用最近报道的远红色有机染料HBmito Crimson[12]标记线粒体。内质网和线粒体的延时双色STED成像400秒，间隔时间为8秒，可显示内质网和线粒体的膜紧密接触（图四h），两个细胞器以协调的方式移动，它们的相互作用没有任何明显的中断（图四i）。以上结果表明，mScarlet3-H是一种独特且有前景的RFP候选者，信噪比高，特异性强，适用于固定样本和双色活细胞STED成像。
综上所述，研究者开发了一种超稳定的单体红色荧光蛋白mScarlet3-H，表现出多项优势，包括快速成熟、真正单体状态以及对化学物质、热量和辐射的稳定性增强。相比其他红色荧光蛋白，mScarlet3-H代表了一种超稳定的单体红色荧光蛋白，适用于高级显微镜和生物技术的应用，可用于细胞培养和模式生物的多模态显微镜成像，成为开发新型荧光生物传感器的优秀模板。
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