技术分享：Parkin-PINK1和OMA1双重调控线粒体融合
细胞可对多种致病性和外源性应激做出反应来保护线粒体。线粒体应激反应受损与神经退行性疾病、心力衰竭和代谢综合征有关。然而，这些应激反应途径在生理条件下的作用仍然难以捉摸。当线粒体功能障碍时，可诱导两种应激感应系统Parkin-PINK1和OMA1。受损线粒体去极化，膜电位降低，使得PINK1聚集在线粒体膜表面，进而磷酸化激活Parkin，后者是一种泛素E3连接酶[1, 2]。Parkin泛素化的线粒体蛋白质涉及线粒体融合、降解、线粒体囊泡和生物发生[3]。Parkin和PINK1缺陷会导致散发性和家族性的帕金森病[4]。OMA1是线粒体内膜中的一种金属蛋白酶，与Parkin-PINK1类似同样在线粒体膜电位降低后被激活[5]。活化的OMA1切割线粒体融合GTP酶视神经萎缩蛋白1（OPA1），从而抑制线粒体融合。活化的OMA1还切割线粒体蛋白DAP3结合细胞死亡增强子1（DELE1），将其释放到细胞质中，进而激活综合应激反应（ISR）[6, 7]。然而，在正常生理条件下，Parkin、PINK1或OMA完全敲除（KO）小鼠的线粒体功能和动物生理学都没有明显缺陷[8]。提示Parkin-PINK1和OMA1可能主要在响应外源性应激时发挥作用，而在无应激条件下不是必需的。或者在正常的生理条件下，这两种应激感应系统仍具有关键功能，只是单一防御系统的缺失可被另一个补偿。
2024年2月，Nature期刊报道了一项研究，发现两种线粒体应激反应系统——泛素E3连接酶Parkin和金属蛋白酶OMA1协同发挥作用，通过抑制外膜GTP酶MFN1和内膜GTP酶OPA1介导的线粒体融合来保护线粒体结构和基因组。尽管Parkin或OMA1的单一缺失不会影响线粒体的完整性，但它们的共同缺失会导致小鼠体型变小、运动活动减弱、过早死亡、线粒体异常和先天免疫反应。揭示Parkin和OMA1维持着一种双重调节机制，即使在没有外源性应激的情况下，也协同调控着两层膜上的线粒体融合[9]。
鉴于Parkin、PINK1或OMA1完全敲除（KO）小鼠的线粒体功能和动物生理学没有明显的缺陷（图一a-d，e（i，ii）），研究者构建Parkin和OMA1双敲除小鼠（Parkin-/-Oma1-/-）。发现小鼠体型非常小，出现过早死亡，平均存活期约为70天（图一a-c，e（iii）），在开放场测试中表现出显著降低的运动活动（图一d）。Parkin-/-Oma1-/-小鼠还出现了癫痫发作，而在野生型（WT）和单KO小鼠中没有。为了确定PINK1的缺失是否与Parkin相似，研究者构建了Pink1-/-Oma1-/-小鼠，其表型复制了Parkin-/-Oma1-/-小鼠（图一a-d，e（iii）），表明Parkin-PINK1和OMA1协同保护小鼠的发育、生理和存活。
图一 Parkin-PINK1和OMA1通过抑制线粒体融合来确保小鼠健康[9]
金属蛋白酶OMA1切割灭活线粒体融合中的OPA1 [10]。为了确定OPA1的重要性，在Parkin-/-Oma1-/-小鼠中引入OPA1杂合KO（Parkin-/-Oma1-/-Opa1+/-），OPA1纯合KO导致胚胎致死。杂合OPA1的缺失在体型、存活率和运动活动方面显著挽救了Parkin-/-Oma1-/-小鼠表型（图一a-d，e（iv））。OPA1介导了线粒体融合和内膜嵴形成。为了区分OPA1的这两种功能，研究者在Parkin-/-Oma1-/-小鼠中引入了MFN1杂合KO，MFN1能调控线粒体融合，但不调控嵴结构形成。发现Parkin-/-Oma1-/-Mfn1+/-小鼠表型与Parkin-/-Oma1-/-Opa1+/-小鼠相似（图一a-d，e（iv）），表明在没有外部线粒体应激的情况下，Parkin和OMA1调节OPA1-MFN1融合机制。与MFN1相反，MFN2的杂合缺失没能挽救Parkin-/-Oma1-/-小鼠表型（图一a-d）。MFN2与MFN1同源，在内质网-线粒体接触位点形成和线粒体自噬中发挥作用[11]。这些数据与之前的研究一致，表明OPA1-MFN1比OPA1-MFN2更有效地介导线粒体融合[12]。测试另一种OMA1底物DELE1在综合应激反应（ISR）中的作用，使用CRISPR构建系统性Dele1-/-小鼠，并将其与Parkin-/-小鼠杂交。如果Parkin-/-Oma1-/-小鼠的表型是由Parkin和OMA1介导的ISR联合缺失引起的，那么Parkin−/−Dele1-/-小鼠将复制Parkin-/-Oma1-/-表型。然而，Dele1-/-和Parkin-/-Dele1-/-小鼠的体型、存活率和运动活动都正常（图一a-d）。以上数据表明，Parkin-/-Oma1-/-小鼠的缺陷与线粒体融合的增强有关，而不是与ISR的抑制有关。
为确定Parkin和OMA1的缺失是否影响线粒体形态，研究者使用激光共聚焦免疫荧光显微镜，结合线粒体蛋白丙酮酸脱氢酶（PDH）抗体染色，系统性定量评估了十个脑亚区和八个主要器官（心脏、肾脏、棕色脂肪组织、骨骼肌、肺、肝脏、肠道和脾脏）的线粒体形态（图二a-c）。线粒体形态分析表明，Parkin或OMA1的单一KO不会影响线粒体形态（图二a-c）。相比之下，Parkin-/-Oma1-/-小鼠在多个器官中表现出线粒体增大（巨型线粒体），在大脑和心脏中尤为显著（图二a-c）。在大脑中，脑桥/延髓显示出最高的巨型线粒体形成频率（图二b、c）。透射电子显微镜显示，在脑桥/延髓和心脏中，增大的线粒体含有较少的内膜嵴（图二d）。而Parkin-/-Oma1-/-Opa1+/-或Parkin-/-Oma1-/-Mfn1+/-小鼠强有力地挽救了Parkin-/-Oma1-/-小鼠的线粒体形态增大和嵴结构紊乱表型（图二a-d）。因此，Parkin-/-Oma1-/-小鼠的线粒体动力学平衡倾向于发生融合而非分裂。以上数据表明，Parkin和OMA1在生理条件下可以防止线粒体的过度融合。
图二 Parkin和OMA1可防止线粒体过度融合[9]
接下来，研究者探究Parkin和OMA1缺失的额外影响。对WT、Parkin-/-Oma1-/-、Parkin-/-Oma1-/-Opa1+/-和Parkin-/-Oma1-/-Mfn1+/-小鼠的脑桥/延髓进行RNA测序（RNA-seq）。基因集富集分析（GSEA）显示，与WT相比，Parkin-/-Oma1-/-脑桥/延髓中参与免疫反应的基因上调（图三a和b）。在Parkin-/-Oma1-/-Opa1+/-和Parkin-/-Oma1-/-Mfn1+/-小鼠脑桥/延髓中，这些免疫反应基因的表达模式恢复到接近WT水平（图三b），表明Parkin-/-Oma1-/-脑桥/延髓中发现的基因表达升高是由于过度融合，而不是Parkin缺失引起的自噬缺陷。
图三 Parkin和OMA1保护线粒体基因组[9]
线粒体DNA释放到细胞质中，可通过STING诱导先天免疫反应[13]。使用激光共聚焦免疫荧光显微镜和图像定量技术检测WT和Parkin-/-Oma1-/-小鼠脑桥/延髓的线粒体DNA（mtDNA），发现在WT线粒体外的区域观察到DNA信号低于1%（图三c和e）。同样地，Parkin-/-Oma1-/-脑桥/延髓中线粒体形态正常的细胞，也显示出正常的mtDNA大小和线粒体外DNA水平（图三c-e；正常线粒体）。相比之下，Parkin-/-Oma1-/-脑桥/延髓中线粒体增大的细胞，表现出mtDNA大小和线粒体外DNA水平显著增加，上升到6-7%（图三c-e；巨型线粒体），表明Parkin-/-Oma1-/-脑桥/延髓的mtDNA是从增大线粒体中释放的，而不是从正常线粒体释放的。核质分离结合qPCR证实mtDNA释放到Parkin-/-Oma1-/-脑桥/延髓的细胞质中（图三f），免疫印迹证实细胞质部分的均一性（图三g）。为了解STING在Parkin-/-Oma1-/-小鼠表型中的作用，使用STING缺陷的Stinggt/gt小鼠[14]构建三重纯合突变小鼠，发现STING缺陷显著改善了Parkin-/-Oma1-/-小鼠的体型和死亡率（图三h-j），强调了STING在这些表型中的关键作用。
线粒体分裂GTP酶DRP1缺失引起的线粒体增大，导致MFN1减少和OPA1切割增加，从而抑制肝细胞和其他细胞中的过度线粒体融合。由于在Parkin-/-Oma1-/-小鼠的肝脏中没有形成巨型线粒体（图二），研究者测试Parkin和OMA1是否在线粒体分裂应激下保护肝脏，构建DRP1（Alb-Cre::Drp1flox/flox），Parkin;OMA1（Alb-Cre::Parkinflox/floxOma1flox/flox），以及DRP1;Parkin;OMA1（Alb-Cre::Drp1flox/floxParkinflok/floxOma1flox/flox）的肝细胞特异性敲除小鼠。所有这些肝脏特异性KO小鼠的体重都正常（图四a）。与其他三种小鼠相比，三重KO小鼠表现出轻微的肝脏增重（图四b）。如激光共聚焦免疫荧光显微镜（图四c-e）和透射电子显微镜（图四f-k）所示，Parkin;OMA1肝脏特异性KO对肝脏线粒体形态没有严重影响，与Parkin;OMA1的全身性双KO一致（图二）。正如预期，DRP1肝脏特异性KO增加了巨型线粒体频率（图四d）、线粒体大小（图四e和g）、周长（图四h）和嵴紊乱（图四i），线粒体失去了管状形态，纵横比降低（图四j），圆形度增加（图四k）。值得注意的是，三重KO小鼠肝脏进一步增强了DRP1表型。免疫印迹显示，DRP1的肝脏缺失增加了OMA1介导的OPA1切割产物（S3和S5），减少了OPA1的OMA1底物形式（L2），降低了MFN1和MFN2水平（图四l和m）；Parkin和OMA1的额外缺失部分逆转了这些变化（图四l和m）。以上数据表明，当线粒体分裂减少时，Parkin和OMA1可以防止线粒体进一步增大。
图四 Parkin和OMA1抑制应激诱导的肝脏线粒体增大[9]
DRP1 KO肝脏中的线粒体增大会降低线粒体自噬作用，导致泛素和p62在线粒体上积累，而p62是泛素连接酶复合物的接头蛋白和亚基。这些泛素化、增大的线粒体是停滞的线粒体自噬中间体，它们的泛素化需要p62，且不需要Parkin或PINK1。与这些研究相一致，研究者发现DRP1 KO肝脏中线粒体增大，泛素和p62积累（图四n和o）。Parkin和OMA1的额外损失进一步增加了三重KO肝脏中这种停滞的自噬中间体，而Parkin和OMA1双KO肝脏没有显示出这种中间体（图四n和o）。为了直接检测线粒体自噬，将表达线粒体自噬生物传感器的质粒，基质靶向的Su9-mCherry-GFP，尾静脉注射递送到四组小鼠的肝脏中（图四p和q）。正常情况下，可在线粒体内观察到mCherry和GFP双信号；发生线粒体自噬后被转运到溶酶体，因溶酶体的酸性pH值，只有mCherry信号可被检测到。尾静脉注射后四天，量化肝切片中mCherry和GFP信号之间的比率，记录线粒体自噬通量（线粒体自噬指数）。DRP1 KO肝脏的线粒体自噬指数显著降低，三重KO肝脏的这一缺陷显著加剧（图四p和q）。而Parkin和OMA1双KO肝脏的线粒体自噬没有减少，与WT组接近（图四p和q），表明尽管Parkin和OMA1不参与肝脏线粒体的泛素化，但它们在调节线粒体大小方面起着重要作用，进而影响线粒体自噬。DRP1 KO肝脏导致血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）增加，Parkin和OMA1的额外缺失进一步提高了三重KO小鼠的血清ALT水平（图四r）。以上数据表明，在线粒体分裂缺陷的压力下，Parkin和OMA1共同确保线粒体完整性和肝脏健康。
综上所述，该研究通过构建18种KO/突变小鼠模型，发现Parkin-PINK1和OMA1介导了一种线粒体的双重调控机制，分别在外膜和内膜融合阶段调节线粒体融合。Parkin-PINK1或OMA1的存在可以维持线粒体形态，防止其过度融合。Parkin和OMA1的双重敲除消除了这两种抑制机制，导致小鼠出现体型小、运动活性低、过早死亡、线粒体异常和先天免疫反应。该研究还揭示了这种双重调节机制的组织特异性影响，其中对脑的影响最大，可为人类健康和帕金森等疾病提供重要见解。
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