技术分享： LXRα突变揭示胆固醇感应在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）中的作用
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）估计影响全球35%的人群[1]。MASLD本身可能是相对良性的，但约25%的患者会发展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），而MASH会增加肝硬化、肝细胞癌和肝功能衰竭的风险[2]。MASLD的特征是肝脏脂肪的过度积累，并且经常观察到脂肪酸从头合成的速率升高[3]。大多数MASLD患者并不发展成MASH，目前尚不清楚是肝脏脂肪增加单独导致转变成MASH，还是需要额外的触发因素。
人类肝脏里的胆固醇水平与MASH的严重程度相关，临床研究表明MASH患者可从抑制胆固醇合成的他汀类药物中获益[4, 5]。然而，胆固醇直接影响疾病的机制尚不清楚。核受体LXRα是肝脏主要表达的肝X受体亚型，在脂质代谢的转录调控中发挥着关键作用。LXRα是一种细胞内胆固醇水平传感器，可直接结合胆固醇衍生物，进而转录调控靶基因的表达来维持脂质稳态。LXRα基因缺失会损害胆固醇的分解代谢和排泄，也会减少脂肪酸从头合成[6, 7]。由于脂肪酸合成的增加被认为是主要驱动MASLD脂肪变性因素，因此已提出通过抑制LXR活性来治疗脂肪变性肝病的潜在治疗方法[8]。人类全基因组关联研究也发现与脂质水平和胰岛素敏感性相关的LXRα基因（NR1H3）突变[9, 10]。然而，尚不清楚LXRα是否在脂肪变性转变为MASH的炎症和纤维化过程中发挥作用。2025年1月，Nature Communications期刊发表了一项研究，利用核受体LXRα W441F突变小鼠证明肝脏胆固醇升高在MASH的发展中起着关键作用。LXRα W441F发挥显性负调控功能，使其关闭胆固醇感应，损害了LXRα对内源性胆固醇衍生配体的转录反应。突变小鼠在高脂肪、高胆固醇饮食喂养后，迅速发展出MASH表型，包括气球样变肝细胞、免疫浸润和纤维化，并且降低了肝脏甘油三酯，却增加了肝脏胆固醇。通过合成强效LXR激动剂处理突变小鼠重新激活LXR信号传导，可以逆转其MASH表型，表明LXRα的正常功能可阻碍MASH的发展。该研究构建了一种MASH遗传小鼠，为研究MASH相关机制和鉴定LXR信号下游的潜在治疗靶点提供了一种新的快速造模小鼠模型[11]。
基于结构研究和报告基因分析表明，LXR配体结合域羧基末端螺旋12的保守色氨酸（对应小鼠LXRα氨基酸441）突变为苯丙氨酸（W441F），削弱了LXR对胆固醇衍生配体的转录反应所需的螺旋10组氨酸（小鼠氨基酸419）与π阳离子的相互作用。然而，与组氨酸419直接氢结合的强效合成配体如T0901317，可逆转W441F的转录抑制[12]。于是，研究者探索小鼠LXRα W441F突变的影响。在LXRα和LXRβ双敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞中，感染表达小鼠LXRα或LXRα W441F的腺病毒，mRNA定量分析LXR下游靶基因Srebp1c和Scd1。正如预期，表达野生型LXRα的细胞可响应24,25-环氧胆固醇以及合成激动剂T0901317的诱导，增加靶基因的表达；而W441F细胞选择性丧失对24,25-环氧胆固醇的反应。进一步构建Lxrα（Nr1h3）W441F突变小鼠，杂合突变小鼠（W/F）的交配繁殖可按孟德尔比率获得野生型（W/W）和纯合突变型（F/F）后代。在10-12周龄时，W/W、W/F和F/F雌性或雄性小鼠的体重没有显著差异。然而，与W/W对照组相比，W441F小鼠肝脏和肠道中参与胆固醇代谢（图一a-c）和脂肪酸合成（图一d-f）的LXR调节基因显著减少，纯合突变型F/F的减少相对最多。血浆甘油三酯和胆固醇相应降低（图一g和h），这反映了LXR在促进极低密度脂蛋白（VLDL）分泌和高密度脂蛋白颗粒产生方面的作用。突变小鼠的血浆葡萄糖水平略低（图一i），可能发生了肝脏损伤。
图一 LXRα W441F突变小鼠的肝脏靶基因和血浆脂质表征[11]
肝脏切片的组织学H&E染色显示F/F纯合突变小鼠免疫浸润（图二a），油红O染色显示出现大量中性脂质（图二b）。杂合W/F和纯合F/F突变小鼠的肝脏甘油三酯都降低（图二c）。而肝脏胆固醇仅在F/F纯合突变小鼠中增加（图二d和e），表明油红O染色最有可能鉴定出胆固醇负荷细胞。与参与脂肪酸合成的基因相比，杂合突变小鼠中参与胆固醇分解代谢的LXR靶基因受影响较小（图一a-f）。F/F纯合突变小鼠也观察到肝脏肿大，表现为肝脏与体重比更大。此外，F/F纯合突变小鼠肝细胞核中检测到增殖标志物Ki67的染色增加（图二f），表明细胞正在分裂。
图二 LXRα W441F突变小鼠的肝脏胆固醇累积和细胞分裂增加[11]
进一步探索3种基因型小鼠的肝脏基因表达差异。肝脏RNA测序（RNA-Seq）的基因表达主成分分析（PCA）显示，W/F杂合突变比F/F纯合突变更接近W/W对照（图三a）。与W/W对照组相比，W/F杂合突变肝脏有59个差异基因，其中39个基因下调，20个基因上调。GO分析表明，大多数下调基因与脂肪酸代谢有关（图三b），18个基因要么是LXR靶基因，要么是LXR染色质结合位点的临近基因[13]。W/F杂合突变肝脏唯一显著上调的途径与甾醇代谢相关，4个基因被诱导2-2.3倍。与W/W对照组相比，F/F纯合突变肝脏有2000多个差异基因，其中488个基因下调，1688个基因上调。F/F纯合突变肝脏下调基因很大程度上也与脂肪酸代谢有关，上调的主要基因网络富集在细胞分裂、炎症/免疫细胞功能和细胞粘附/细胞外基质（图三b）。定量PCR证实了趋化因子受体Cx3cr1的表达增加（图三c），以及促炎基因如Tnf的表达升高（图三d），这与H&E染色观察到的免疫浸润一致，表明F/F纯合突变肝脏中存在促炎环境。巨噬细胞标志物Cd68的免疫组织化学染色，也可以检测到F/F纯合突变肝脏中巨噬细胞数量的增加（图三 i）；此外，在MASH模型和其他慢性疾病环境中定义的脂质相关巨噬细胞群的标志基因Trem2和Spp1也增加（图三e和f）；而库普弗细胞标志物如Clec4f的表达减少（图三i）；促纤维化基因表达也增加（图三g和h）。
图三 LXRα W441F突变小鼠的肝脏基因表达检测[11]
为检查LXR信号传导对MASH进展的影响，MASH饮食（21%脂肪、1.25%胆固醇、34%蔗糖）喂养11周龄的W441F突变小鼠2周，部分收样后其余继续MASH饮食，并用激动剂T0901317处理2周。MASH饮食2周后，天狼星红染色在杂合和纯合突变小鼠肝脏中都检测到胶原蛋白沉积，在对照药物处理的小鼠中，胶原蛋白沉积在4周时进一步增加（图四a-c）。由于大多数高脂肪/高胆固醇饮食依赖性MASH模型需要几个月的时间才能发展为组织学可检测的纤维化[14]，而W441F突变小鼠快速发展出纤维化，表明LXR活性在调节这一过程中起着关键作用。令人惊讶的是，与对照药物处理的小鼠相比，采用T0901317重新激活LXR信号后，胶原蛋白染色显著减少，与MASH饮食2周时水平相似。检测血浆ALT和AST的水平量化肝脏损伤，也遵循类似的轨迹，重新激活LXR活性也能大大减轻肝脏损伤（图四d-g）。
图四 LXRα W441F突变小鼠存在肝脏损伤和纤维化[11]
MASH饮食小鼠肝脏油红O染色（图五a）显示W441F突变小鼠与对照W/W小鼠相比脂质积累。对照小鼠具有相对较小的强烈染色的脂滴，并且在2至4周之间增加。此外，用已知促进脂肪酸合成的LXR激动剂T0901317处理对照小鼠进一步增加了脂滴的大小。相比之下，杂合和纯合突变小鼠的肝细胞表现出弥漫性脂质染色（图五a），体内的脂质负荷细胞似乎与H&E染色肝脏切片中检测到的气球样变肝细胞相关（图五b），推测这些细胞主要充满胆固醇。与这一假设一致，与W/W对照组相比，突变小鼠在MASH饮食2周和4周后肝脏胆固醇升高，而肝脏甘油三酯降低（图五c-f）。通过T0901317重新激活LXR信号传导可以降低杂合突变小鼠的肝脏胆固醇，但不会显著降低纯合突变小鼠的肝脏胆固醇（图五c-f）。
图五 LXRα W441F突变小鼠在MASH饮食后加重肝脏脂质积累[11]
研究者直接比较MASH饮食4周后，LXRα W441F突变小鼠和LXRα敲除小鼠（AKO）的表型。与W/W对照小鼠相比，AKO敲除小鼠的LXR靶基因下调，但mRNA水平的降低不如W441F突变小鼠明显（图六a-d）。与LXR依赖性基因表达减少相一致，敲除小鼠的肝脏胆固醇增加，肝脏甘油三酯降低（图六e-g）。通过Cd68 mRNA（图六h）测量的巨噬细胞含量在敲除小鼠中明显增加。然而，与敲除小鼠相比，突变小鼠的MASH分子标志物 Trem2和Col1a1的mRNA水平以及AST水平更高（图六i-k）。其他表型包括库普弗细胞标志物表达降低、细胞分裂增加、肝脏和脾脏与体重之比升高以及体重增加减少，在敲除小鼠中不太明显。MASH饮食4周后，敲除小鼠的肝脏胶原蛋白染色没有增加（图六l和m），这与不太严重的MASH表型一致。以上数据表明，敲除LXRα的效果不如W441F突变小鼠表型严重，敲除不会导致同样的纤维化加速发展。然而，LXRα基因缺失确实会产生促炎和促纤维化的环境，这可能有利于在稍长的时间内纤维化的发展。
图六 LXRα W441F突变小鼠和LXRα敲除小鼠的比较[11]
LXRα在所有导致MASH的细胞类型中都有表达，包括肝细胞、库普弗细胞、浸润巨噬细胞和肝星状细胞[6]。然而，肝细胞中异常的脂质积累被认为是人类和小鼠模型中MASH的最初驱动因素[2]。为确定LXRα W441F在肝细胞中的选择性表达是否足以促进小鼠的MASH表型，使用CRISPR Cas9在Rosa26基因座插入Cre依赖性Lox-Stop-Lox盒控制表达的FLAG-LXRα W141F（Rosa26-LSL-FLAG-Lxrα W414F）。将Rosa26-LSL-FLAG-Lxrα W414F插入到Lxrαfl/fl小鼠，感染肝细胞特异性甲状腺素结合球蛋白（TBG）启动子驱动表达的Cre AAV，使得Cre介导LXRα W441F表达的同时切除野生型Lxrα等位基因（图七a）。该小鼠正常饮食2周，再换成MASH饮食4周。肝脏蛋白质印迹表明感染TBG-Cre的小鼠表达FLAG-W441F蛋白量是感染TBG-GFP对照组的10倍左右（图七b）。在MASH饮食4周后，该小鼠表现出与W441F突变小鼠基本相同的表型，包括脂质负荷的气球样变肝细胞（图七c和d）、肝脏甘油三酯降低（图七e）、肝脏胆固醇升高（图七f）、弥漫性脂质染色（图七g和h）、胶原蛋白沉积增加（图七i-k）、ALT升高（图七l）、LXR直接靶基因Srebp1c和Abcg5下调（图七m和n），以及浸润巨噬细胞、脂质相关巨噬细胞、纤维化和细胞分裂的标志物上调（图七o-t）。以上数据表明，特异性抑制肝细胞的LXR转录活性足以快速促进MASH相关表型。
图七 肝细胞特异性表达LXRα W441F促进MASH进展[11]
综上所述，研究者证明破坏LXRα感知胆固醇能力的LXRα W441F突变体，即使在杂合状态下也能抑制LXR依赖性转录。暴露于高脂肪、高胆固醇的MASH饮食2周后，W441F突变小鼠就能快速出现人类MASH的特征，表现为肝酶升高、炎症和纤维化，表明肝脏胆固醇积累是驱动MASH炎症和纤维化的一个关键触发因素。突变小鼠MASH饮食2周后，采用长效激动剂重新激活LXR信号，可阻断纤维化的进一步进展，并且完全（杂合子）或部分（纯合子）逆转肝脏损伤和炎症。该研究提供了一种LXRα W441F突变小鼠模型可快速实现MASH造模，助力鉴定促进MASH发展的因素，以及LXR信号下游的潜在治疗靶点。
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