技术分享：肿瘤通过线粒体转移实现免疫逃逸
癌细胞在肿瘤微环境（TME）里可通过多种机制逃避免疫监视，如创造有利于肿瘤进程的免疫抑制分子和细胞[1]。抑制性免疫检查点分子，例如细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）、程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配体PD-L1/2，在这一过程中起关键作用。免疫检查点抑制剂（ICI）包括抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4单克隆抗体，已在各种癌症类型中改善患者的生存率，但仍有许多患者无法受益或者疗效不能持久[2, 3]。因此，充分认识癌细胞的各种免疫逃逸机制对于提高ICI疗效至关重要。
肿瘤微环境的代谢重编程对于抗肿瘤免疫反应至关重要[4]。肿瘤内的低氧和低葡萄糖环境促进了糖酵解而非氧化磷酸化（OXPHOS）。这种转变影响了T细胞效应功能、耗竭、衰老和记忆形成，使其有助于癌细胞的生存。此外，肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）中的线粒体发生功能障碍，导致代谢不足，随后T细胞进入终末分化耗竭状态[5]。然而，造成TIL线粒体功能障碍的机制尚不清楚。
线粒体DNA（mtDNA）编码了重要蛋白质用于能量生成，但因其修复机制较弱而容易发生突变。mtDNA的许多突变会导致氧化磷酸化受损，促进各种癌症的肿瘤生长和转移[6]。然而，很少有研究探讨它们对于抗肿瘤免疫的影响。线粒体转移可发生在不同细胞之间，进而改变受体细胞的线粒体代谢。体内缺乏mtDNA导致氧化磷酸化受损的癌细胞会从宿主细胞获取线粒体基因组，以恢复线粒体呼吸[7]。有研究揭示癌细胞通过隧道纳米管（TNT）从T细胞获取线粒体，从而阻碍抗肿瘤反应[8]。此外，细胞外囊泡（EV）可以通过与细胞融合实现将线粒体运输到不同的细胞里[9]。尽管在肿瘤微环境中，线粒体可以从癌细胞转移到T细胞，但这一过程的发生率及其对于抗肿瘤免疫的影响尚不清楚。
2025年2月，Nature期刊发表了一项研究，发现肿瘤来源的线粒体转移到肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）中导致线粒体功能障碍以及损害抗肿瘤免疫反应。具体而言，通过分析多种癌症临床样本发现TIL中存在与癌细胞线粒体DNA（mtDNA）相同的突变，这种突变是由携带mtDNA突变的癌细胞通过线粒体转移所获得。T细胞获得癌细胞的mtDNA突变线粒体后，表现出代谢异常和衰老、效应功能和记忆形成缺陷，最终导致体内和体外的抗肿瘤免疫受损。该研究揭示了一种通过线粒体转移逃避癌症免疫的新机制，有助于发展未来癌症免疫疗法。
为理解肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）中线粒体功能障碍的机制，研究者首先对12名不同类型癌症患者的TIL mtDNA进行测序。分析显示，12名患者中有5人TIL存在mtDNA突变（图一a），TIL主要由CD45+ CD3+ T细胞组成，并且分选后的T细胞具有相同的突变（图一b和c）。从7名患者中建立了对应的癌细胞系，其中4名患者的TIL含有mtDNA突变。值得注意的是，这4个TIL中有3个与对应的癌细胞共享相同的突变（图一a和c）。另外，从携带突变mtDNA（3290T>C）的TIL04细胞中建立了一个野生型mtDNA的单个T细胞克隆TIL04#9。电子显微镜成像显示，不携带mtDNA突变的PBL04（匹配的外周血淋巴细胞）和TIL04#9可观察到正常形态的线粒体，而在携带mtDNA突变的TIL04和癌细胞MEL04中发现线粒体形态异常，表现为嵴减少（图一d）。为了确认mtDNA突变不是在培养过程中发生的，研究者分析患者04的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织，发现该组织样本也具有相同的突变（图一e）。以上数据表明，在TIL和对应的癌细胞中，它们的mtDNA存在相同的突变。
图一 TIL和对应癌细胞共享相同突变的mtDNA [10]
线粒体可以在不同细胞之间发生转移[9]。于是，研究者推测癌细胞和TIL中观察到的相同mtDNA突变可能是由于线粒体转移引起的。为了避免假阳性并准确评估转移过程，将特异性线粒体荧光蛋白MitoDsRed引入MEL02细胞（野生型mtDNA）和MEL04细胞（突变型mtDNA），分别称为MEL02-MitoDsRed和MEL04-MitoDsRed。将TIL与这些癌细胞共培养，24小时内几乎没有发生线粒体转移，而24小时后出现DsRed+ T细胞，表明发生了从癌细胞向T细胞的线粒体转移（图二a和b）。TNT的形成和EV的释放可以促进线粒体转移，研究者在不同条件下评估线粒体转移（图二c）。发现在TNT抑制剂细胞松弛素B处理、避免直接细胞-细胞接触的插入式细胞培养器（3 μm和0.4 μm）培养以及阻止小EV（约200 nm）释放的化合物GW4869处理，都能显著减少线粒体向TIL转移（图二c），表明肿瘤浸润性T细胞通过直接和间接的方式从癌细胞获得线粒体及其mtDNA。
图二 携带mtDNA突变的癌细胞线粒体可转移到TIL中，并逐渐取代原线粒体[10]
接下来，研究者探究线粒体转移后是否发生同质化。在与MEL04细胞共培养后，分选TIL04#9细胞的单个CD45+ CD3+ T细胞，并在不同时间点对单个T细胞的mtDNA进行测序。共培养14天后，部分T细胞中发生了线粒体的同质化替换（图二d）。使用MitoTracker Green标记的TIL04#9细胞与MEL04-MitoDsRed细胞共培养，进行延时成像。在多个TIL中，MitoTracker Green水平逐渐降低，而来自癌细胞的DsRed信号在共培养后逐渐增加。最终，TIL的MitoTracker Green信号被DsRed取代，表明线粒体替换直至均质，并且这种效果得以维持（图二e和f）。进一步确认体内线粒体转移情况，使用携带mtDNA Nd6 13997G>A突变的LLC/A11细胞系，进行MitoDsRed标记。将这个癌细胞接种到C57BL/6J小鼠体内后，在第21天和第42天收集肿瘤并分析TIL，观察到TIL中DsRed+ T细胞的比例逐渐增加，这表明LLC/A11细胞发生了体内线粒体转移（图二g和h）。单细胞分选TIL中的DsRed+ T细胞进行mtDNA测序，发现DsRed+ T细胞中存在单细胞水平的mtDNA突变，其中一些为均质的纯合性突变（图二i）。相比之下，所有DsRed- T细胞都具有野生型mtDNA（图二i）。以上数据表明，线粒体从癌细胞转移到TIL后发生了同质化替代。
研究者进一步探究线粒体转移的同质替代机制。将表达MitoDsRed的癌细胞和T细胞共培养后，可见T细胞中的DsRed逐渐增加；相比之下，MitoTrackerGreen标记的T细胞线粒体数量在共培养后减少（图三a）。癌细胞产生的反应性氧化物（ROS）可在TME中引起周围细胞发生自噬，ROS可被N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理所清除。在共培养条件下，NAC处理防止了T细胞原线粒体数量的减少（MitoTracker Green染色），并且未发生线粒体的同质化替代（图三b和c）。用LC3B染色显示，与MEL04-MitoDsRed细胞共培养增强了T细胞的自噬水平，而NAC处理则降低了自噬水平（图三d和e）。分析TIL在获得线粒体后的基因表达情况，与TIL04#9细胞或DsRed-TIL04#9细胞（野生型mtDNA）相比，DsRed+ TIL中与自噬和线粒体应激反应相关的基因表达水平更高（图三f）。采用自噬抑制剂巴佛洛霉素A1阻止了T细胞中原线粒体数量的减少（图三g）。以上结果表明，T细胞的原位线粒体对ROS诱导的自噬敏感，而来自癌细胞的线粒体则具有抗性，这种自噬敏感差异可能导致线粒体转移后的同质化替代。
图三 癌细胞线粒体对自噬具有抗性得益于USP30[10]
随后，研究者详细研究造成线粒体自噬敏感性差异的原因，推测与线粒体一起转移的特定癌细胞因子可能赋予T细胞这种抗性。为此，研究者寻找附着在线粒体上的线粒体自噬抑制分子。Parkin介导的泛素化对于线粒体自噬至关重要，去泛素化酶USP30、USP33和USP35可以抑制Parkin介导的线粒体自噬并附着在线粒体上。根据癌症基因组图谱的数据，USP30在黑色素瘤中高表达，并且可以抑制线粒体自噬。正如预期，USP30在癌细胞的表达较高，在突变mtDNA的TIL略有增加，但在野生型mtDNA的TIL和PBL表达较低。与癌细胞共培养后，USP30与癌细胞的线粒体一起转移到TIL（图三h和i）。USP30抑制剂CMPD-39处理可部分减少癌细胞MitoDsRed向TIL的线粒体转移，从而部分阻止了同质化替代（图三j和k）。考虑到CMPD-39可能的非靶向效应，使用了两种针对USP30的siRNA（siUSP30-1和siUSP30-2），也得到了类似的结果（图三j和k）。以上结果表明，得益于抑制线粒体自噬的分子如USP30一同从癌细胞发生转移，使得癌细胞来源线粒体在转移后不会发生自噬，而T细胞的原线粒体由于ROS经历自噬，最终导致线粒体的同质替代。
接下来，研究者评估T细胞接受癌细胞线粒体后的线粒体功能变化。基于DsRed表达，研究与黑色素瘤细胞共培养后，携带野生型线粒体或者mtDNA突变线粒体的TIL功能（图四a）。由于建立的TIL主要由CD8+ T细胞组成，因此主要评估CD8+ T细胞的功能（图一b）。mtDNA突变TIL（DsRed+ TIL04#9/04细胞）膜电位显著降低（图四b），ROS生成显著增加（图四c），增加了β-半乳糖苷酶活性以及衰老分子p16和p53的水平（图四d-f），CD27– CD28– 衰老比例和衰老相关的分泌表型如IL6、CXCL8和IL1B，也有所增加（图四g-j）。一致地，其细胞分裂潜力降低，凋亡更多（图四k和l），CCR7highCD45RAlow中央记忆细胞比例和长寿KLRG1low细胞比例显著减少（图四m和n）。使用抗CD3和抗CD28单克隆抗体刺激T细胞，发现mtDNA突变TIL（DsRed+ TIL04#9/04细胞）的激活标记PD-1和CD69显著减少（图四o和p），表明线粒体功能受损，mtDNA突变TIL无法被有效激活。在乳腺癌细胞MDA-MB-231上重复实验显示出相似的结果。以上结果表明，接受癌细胞来源的mtDNA突变线粒体，使得T细胞变得衰老，且在效应功能和记忆形成方面存在缺陷，同时伴有代谢异常。
图四 突变mtDNA线粒体转移到TIL后削弱其功能[10]
最后，研究者评估体内效果。将MitoDsRed引入携带野生型mtDNA的小鼠Lewis肺癌LLC/P29细胞，在移植后第42天分析LLC/P29-MitoDsRed和LLC/A11-MitoDsRed（携带mtDNA突变）肿瘤中的TIL。LLC/P29和LLC/A11肿瘤中CD8+ T细胞浸润情况相当，肿瘤浸润CD8+ T细胞中DsRed的表达也相当（图五a）。与野生型mtDNA LLC/P29细胞相比，DsRed+ CD8+ T细胞在接受了LLC/A11肿瘤mtDNA突变线粒体后，表现出显著更高的β-半乳糖苷酶活性，更易发生凋亡（图五b和c），CD127highKLRG1low长寿记忆前体效应T细胞（MPEC）比例降低（图五d），PD-1表达显著降低（图五e），TIM3高表达而TCF1低表达的耗竭表型比例增多（图五f），与体外实验结果类似。此外，将LLC/P29或LLC/A11肿瘤移植到OT-1小鼠体内，从TIL中收集DsRed+ CD8+ T细胞，进行OVA过表达癌细胞的杀伤试验。与野生型mtDNA LLC/P29细胞相比，LLC/A11细胞mtDNA突变的线粒体转移显著降低了细胞毒性活性（图五g）。值得注意的是，LLC/P29肿瘤对PD-1阻断有反应，而mtDNA突变的LLC/A11肿瘤没有反应，且PD-1阻断不影响线粒体转移（图五h）。使用EV释放抑制剂GW4869处理这些肿瘤，减少了线粒体转移的发生，进而降低β-半乳糖苷酶活性和减少细胞凋亡（图五i-k），增加了TIL中MPEC和PD-1+ CD8+ T细胞的比例（图五l和m），逆转了耗竭表型（图五n）。GW4869处理抑制了LLC/A11肿瘤生长，但不影响LLC/P29肿瘤生长，并克服了LLC/A11肿瘤对PD-1阻断的抵抗（图五h）。以上结果表明，接受癌细胞转移的mtDNA突变线粒体导致T细胞功能障碍，降低其抗肿瘤免疫，包括PD-1阻断免疫。
图五 接受mtDNA突变线粒体会降低体内抗肿瘤免疫[10]
综上所述，研究者分析了各种癌症类型的临床样本，发现肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）中存在和癌细胞一样的线粒体DNA（mtDNA）突变，证明了这种突变是通过癌细胞线粒体转移所获得。癌细胞将mtDNA突变线粒体转移到TIL中，导致TIL线粒体功能障碍并损害其体内抗肿瘤免疫。具体来说，携带mtDNA突变线粒体的T细胞表现出代谢异常和衰老，效应功能和记忆形成缺陷，进而影响PD-1阻断免疫。已知癌细胞可从宿主细胞劫持正常线粒体来支持自身生长，这一发现丰富了反向输出的结果，揭示了癌细胞也能将mtDNA突变的线粒体转移到宿主细胞来实现免疫逃逸，为未来开发免疫疗法提供了新的方向。
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