技术分享：MTFP1抑制线粒体内膜融合并维持mtDNA水平
线粒体是双膜结构细胞器，具有线粒体外膜（OMM）和内膜（IMM）。IMM伸入线粒体基质中，后者含有以蛋白质-DNA复合物形式存在的线粒体基因组，称为类核[1]。线粒体DNA（mtDNA）编码了呼吸链不同复合物的13个核心亚基，对维持细胞代谢和生命至关重要。维持细胞稳态仅需要两个拷贝的核DNA（nDNA），而mtDNA分子的数量可以从数百到数千个拷贝不等，具体取决于细胞类型和细胞需求[2]。与核DNA不同，mtDNA独立于细胞周期不断“松弛复制”，其拷贝数在细胞水平上受到严格调控，但对其潜在调控机制知之甚少。线粒体可通过分裂和融合，形成一个动态的、相互连接的网络。精准调控线粒体动力学是维持mtDNA水平所必需的，也是线粒体质量控制的关键[3]。线粒体分裂可将受损细胞器区域分离成小的线粒体，促进其自噬降解[4]。根据损伤的来源和严重程度，分离的线粒体可能与更健康的线粒体重新融合，以减轻功能障碍。线粒体分裂蛋白1（MTFP1）是一种整合的IMM蛋白，以前被认为是作用于动态相关蛋白1（DRP1）上游的促分裂因子[5]，将分裂过程与驱动细胞命运的多种关键途径相耦合，如雷帕霉素复合物1（mTORC1）激活靶点、细胞死亡、癌症进展和线粒体生物能量[6, 7]。然而，MTFP1如何调节线粒体动力学以及如何影响mtDNA水平仍然未知。
2024年7月，Cell期刊报道了一项研究，发现线粒体内膜（IMM）蛋白MTFP1是IMM融合的负调控因子。机制上，MTFP1抑制线粒体融合，将受损的IMM亚结构域与其他部分相分离，通过外周分裂确保它们分离到富含MTFP1的小线粒体（SMEM），随后以自噬依赖的方式被降解。这是一个MTFP1依赖的IMM质量控制过程，细胞利用这一过程回收线粒体类核，以维持生理mtDNA水平[8]。
首先，为了深入了解MTFP1如何调节IMM的膜重塑，研究者进行了详细的线粒体形态学分析。在U2OS细胞中沉默DRP1发现少数但细长的线粒体，相反，沉默MTFP1诱导了广泛相互连接的线粒体网络，这与过度的线粒体分支有关（图一A-D）。使用超分辨晶格结构光照明显微系统（SR-SIM）活细胞成像在野生型（WT）和MTFP1-KO细胞中测量线粒体分裂（图一E）。尽管MTFP1-KO细胞的中区分裂不受影响，但外周分裂显著降低（图一F和G），表明MTFP1可能是外周线粒体亚结构分裂所必需的。与此一致，MTFP1-KO细胞显示出小圆形线粒体的数量减少（图一H）。相反，过表达MTFP1与小圆形线粒体的形成增加相关（图一I），表明MTFP1促进外周分裂。将MTFP1沉默细胞的线粒体表型与其他细胞线粒体表型进行比较，MFF沉默细胞具有与DRP1沉默细胞相似的细长表型，FIS1沉默细胞仅表现出适中的过度融合线粒体网络（图一J-L）。随后，研究者分析线粒体融合过程的动态，该过程有两种不同模式：完全融合形成单个稳定的线粒体，或者瞬时融合且在同一区域迅速发生DRP1驱动的分裂（图一M）。在MTFP1-KO细胞中，完全融合率增加，瞬时融合率降低（图一N和O）。随着时间的推移，线粒体融合能力增加（图一P-R）。以上数据表明，MTFP1缺失诱导的线粒体分支和相互连接与融合能力增加有关，而不是线粒体分裂减少，表明MTFP1是一种阻止线粒体融合的IMM蛋白。
图一 MTFP1缺失增加线粒体融合[8]
接下来，研究者探究MTFP1如何同时调节线粒体融合和外周分裂。使用SR-SIM分析MTFP1分布发现该蛋白在线粒体亚区表现为不均匀定位。虽然MTFP1在小片段线粒体内均匀分布，但还观察到MTFP1向线粒体外周的特定分布，另外还沿着IMM亚结构域在线粒体中心区域积累，勾勒出“间隔样”结构（图二A）。当IMM融合受到抑制时积累的IMM融合中间体称为线粒体“隔膜”[9]。在隔膜处检测到微弱的残余TOMM20染色，表明之前发生了OMM融合（图二A）。TEM分析证实了这些结果，MTFP1过表达导致线粒体外周形成隔膜以及IMM亚区（图二B）。活细胞成像证实MTFP1在“间隔样”结构和线粒体接触部位的持续定位，其中两个相对的线粒体保持紧密贴壁，但没有完全融合（图二C）。虽然一些富含MTFP1的亚结构域发生外周分裂，形成小线粒体，但大多数MTFP1亚结构域在线粒体外周保持稳定（图二C和D）。值得注意的是，没有观察到富含MTFP1的亚结构域或者小线粒体发生线粒体融合（图二D和E）。以上数据表明，MTFP1本身不驱动不对称膜分裂，而是隔离和保护特定IMM亚结构域，使其不与其他网络相融合，从而指示这些区域进行外周分裂。
图二 MTFP1定位于线粒体外周并抑制IMM融合[8]
为研究MTFP1如何抑制线粒体融合，研究者富集线粒体组分，下拉MTFP1进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），发现其潜在结合蛋白有MFN1、MFN2、OPA1以及一些线粒体接触位点和嵴组织系统（MICOS）组分（图二F）。免疫沉淀证实MTFP1和这些融合机器之间的相互作用（图二G）。然而，1D和2D BN-PAGE分析揭示MTFP1和OPA1、MFN2、MIC60之间有着不同的迁移模式（图二H和I），表明MTFP1与融合机器或MICOS复合物都没有形成稳定的复合物。使用荧光染料10-N-壬基吖啶橙（NAO）结合线粒体阴离子磷脂，观察到MTFP1-KO细胞表现出异常的线粒体心磷脂（CL）分布，形成富含NAO的微区（图二J）。MTFP1-KO细胞显示出OPA1寡聚体形成增加，而MTFP1过表达降低了高寡聚体OPA1的组装水平（图二K和L）。以上数据表明，MTFP1通过创造非融合脂质环境来抑制线粒体融合，这会影响OPA1的寡聚化及其随后驱动的IMM融合能力。
有研究表明，充足的mtDNA 拷贝数（CN）与线粒体动力学有关[10]。荧光激活细胞分选（FACS）结合单细胞数字液滴（dd）PCR分析显示MTFP1过表达导致mtDNA拷贝数降低（图三A）。另一方面，MTFP1沉默或KO（图三B和C）诱导了mtDNA拷贝数增加，MTFP1过表达后得到了恢复（图三D）。相比之下，DRP1-KO细胞表现出mtDNA拷贝数减少，进一步证实线粒体分裂减少不是出现过度分支的主要原因，也不是mtDNA拷贝数增加的主要原因。MTFP1-KO细胞也对OPA1沉默引起的mtDNA耗竭具有部分抗性，进一步支持了它们在调节IMM融合和mtDNA拷贝数中的相反作用（图三E），表明MTFP1驱动了一种调控mtDNA含量的机制。抑制MTFP1能同时增加非复制以及复制的类核数量，而不影响复制mtDNA/总mtDNA比率（图三F–I），表明缺失MTFP1不会增加mtDNA的复制能力，但可能导致mtDNA清除效率降低，从而导致类核的积累。SR-SIM分析证实，MTFP1-KO细胞中含mtDNA的类核数量增加，但类核大小没有显著改变（图三J和K）。免疫印迹分析显示，MTFP1-KO细胞中积累了核心类核组分，如SSBP、TFAM和TWINKLE（图三L），还检测到IMM蛋白PHB2和线粒体呼吸链亚基水平升高（图三L），它们定位与mtDNA分子非常接近[11]，提示MTFP1可能参与选择性降解含有mtDNA的IMM亚结构域。为阐明MTFP1是否不仅可以用于基础mtDNA降解，还可以用于处理受损的类核，用DNA插入剂溴化乙锭（EB）处理WT和MTFP1-KO细胞。一致地，MTFP1-KO细胞在基础条件下表现出mtDNA水平的增加，并且对EB诱导的类核降解具有部分抵抗力（图三M-O），进一步证实MTFP1对mtDNA清除的贡献。
图三 MTFP1调节mtDNA拷贝数和类核丰度[8]
接下来，研究者探究MTFP1调节mtDNA水平的机制。SR-SIM分析显示，过表达MTFP1不仅促进其在外周积累，还促进形成不含OMM标志物TOMM20但MTFP1阳性的亚区室，其中可能含有mtDNA分子（图四A）。此外，观察到高的MTFP1水平与TOMM20蛋白的低水平相关（图四B）。进一步用两种不同的蛋白酶体抑制剂处理细胞，可减少MTFP1（+）/TOMM20（-）线粒体的数量（图四C），表明蛋白酶体依赖的OMM蛋白周转以及IMM亚结构域的早期降解过程。于是，将这些MTFP1（+）/TOMM20（-）线粒体称为富含MTFP1的小线粒体（SMEM）。为阐明降解途径，检测SMEM与不同溶酶体和自噬标志物的定位情况。观察到SMEM与LAMP1标记的降解溶酶体共定位（图四D和G），也可以在LC3B和p62阳性的自噬体中发现（图四E和F）。用自噬抑制剂氯喹（CQ）处理增加了SMEM的数量（图四H和I）。有报道称，一些IMM组分可以作为LC3受体[12]。事实上，检测到MTFP1和LC3B-II之间存在相互作用，但与细胞溶质LC3B-I之间没有相互作用（图四J），这种相互作用在不同的MTFP1 LIR突变体（mLIR）中被部分破坏，在MTFP1三重LIR突变体中被消除（mLIRx3）（图四K）。有趣的是，MTFP1 mLIRx3仍然能够诱导线粒体断裂（图四L和M）。尽管在MTFP1 mLIRx3过表达的细胞中，SMEM运输到自噬体的数量和百分比都有所减少，但这些结构中仍有一定比例的靶向LC3阳性膜（图四N-P），表明SMEM可被降解，至少部分是独立于MTFP1-LC3B相互作用的。由此，研究者提出线粒体质量控制中MTFP1的两步机制：首先，MTFP1驱动的融合活性丧失与DRP1协同作用，介导外周IMM亚结构选择性分离为小线粒体。由于它们无法进行融合，这些线粒体积累了不可逆的损伤，促进了自噬去除。最后，MTFP1和LC3B之间的相互作用可以提高该过程的效率。
图四 MTFP1介导IMM重塑通过靶向IMM亚结构域的自噬降解[8]
最后，研究者探究MTFP1如何选择需要回收的mtDNA。在WT和MTFP1-KO U2OS细胞中进行二代测序（NGS）实验（图五A）。结果表明，在WT和MTFP1-KO细胞之间，同质或异质线粒体单核苷酸变体（mtSNV）的负荷没有差异（图五B），9种常见异质性mtSNV变异等位基因频率也没有差异（图五C），表明MTFP1驱动的mtDNA周转无法区分不同的mtDNA等位基因。使用稳定表达Flag-MTFP1的MTFP1-KO细胞监测mtDNA损伤期间MTFP1的动态。虽然MTFP1在未处理的细胞中沿IMM均匀定位，但在添加EB后，观察到MTFP1蛋白质向线粒体外周和小线粒体重新分布（图五D）。重要的是，只有约20%的MTFP1外周IMM亚结构域为DNA阳性（图五E），证实MTFP1的重分布不依赖于mtDNA的存在。值得注意的是，PHB2在这些亚结构域富集，但TIMM23没有（图五F），表明并非所有IMM蛋白都与这些外周区域有关。研究者推测MTFP1可能识别IMM的改变，而不是mtDNA本身。SR-SIM揭示MTFP1修饰了mtDNA分子周围的IMM，而不是在类核结构中积累（图五G）。通过瞬时抑制ATP5A或MICOS亚基MIC60来破坏嵴结构，增加了SMEM对自噬溶酶体结构的靶向性（图五H-K）。另一方面，添加羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）或使用MitoParaquat增加线粒体内ROS引起的膜电位损失不会导致MTFP1分布的任何变化，也不会引发SMEM的形成（图五H-M）。以上结果表明，虽然mtDNA损伤会引发IMM改变和随后的MTFP1重新分布，但IMM结构缺陷不一定会导致mtDNA降解。
图五 IMM结构改变后MTFP1外周重分布和SMEM的形成与mtDNA无关[8]
综上所述，该研究揭示了线粒体分裂蛋白1（MTFP1）不是促分裂因子，而是线粒体内膜（IMM）融合的负调控因子。MTFP1阻止了缺陷IMM亚结构域的融合，从而确保其通过外周分裂分离成富含MTFP1的小线粒体（SMEM）。其中，FIS1也对融合过程进行负向控制[13]。一旦被分离出来，SMEM可通过自噬降解，MTFP1和LC3B之间的相互作用提高了这一过程的效率。MTFP1通过抑制IMM融合来调控线粒体内膜的质量控制并维持线粒体DNA（mtDNA）水平，对基础类核循环至关重要。该研究为线粒体质量控制和mtDNA拷贝数调控提供了新的见解。
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