技术分享：泛素连接酶MARCH5调控线粒体来源过氧化物酶体前体的形成
过氧化物酶体的生物合成包含有两条不同途径：成熟过氧化物酶体的生长与分裂和在其他细胞器（内质网ER）上从头生物合成[1]。这两条途径在酵母和人类中都是保守的。此外，在某些情况下，线粒体可能参与过氧化物酶的从头生物合成。例如在过氧化物酶体生物合成障碍（PBD）患者来源的成纤维细胞中，新生成的过氧化物酶体是ER介导的PEX16囊泡和线粒体介导的PEX3囊泡的杂交体[2]，提示了线粒体来源囊泡（MDV）在高等真核生物的过氧化物酶体从头生物合成中的关键作用。
线粒体稳态由多种细胞途径协同维持。错误折叠的外膜蛋白可被泛素连接酶所识别并清除[3]。受损线粒体可被自噬小体完全包裹，随后在溶酶体中进行降解[4]。此外，还能选择性地释放线粒体来源囊泡（MDV）以去除部分受损线粒体[5]。在氧化应激下，过度氧化的蛋白质聚集在线粒体基质，进而触发囊泡形成[6]。最近一项研究表明，TOMM20+ MDV在清除装配好的蛋白质复合物（如TOM复合物）方面发挥着至关重要的作用[7]。因此，MDV被认为是线粒体质量控制的选择途径之一。然而，溶酶体并不是MDV的唯一终点。据报道，含有泛素连接酶MAPL的MDV可特异性靶向过氧化物酶体，该过程依赖于线粒体分裂因子DRP1[8] 。这些发现将MDV与过氧化物酶体联系起来，提示了不同的机制可能调控形成不同的MDV。
泛素连接酶MARCH5对于线粒体稳态维持具有关键作用，通过调节参与分裂和融合的关键蛋白质的泛素化来动态调节线粒体[9]。破坏MARCH5介导的线粒体动态可导致细胞衰老或诱导细胞死亡[10]。此外，MARCH5通过MFN2调节内质网线粒体接触。表明MARCH5积极参与线粒体动力学、蛋白质量控制和细胞器接触位点调控。之前研究证明，MARCH5也定位于过氧化物酶体，在mTOR抑制下介导吞噬作用[11]。在过氧化物酶体缺失的细胞中，一些过氧化物酶体蛋白包括PEX3富集在线粒体上[2]。然而，线粒体定位的MARCH5在过氧化物酶体功能中的作用尚不清楚。
2024年10月，Developmental Cell期刊在线发表了一项研究，报道了位于线粒体的泛素连接酶MARCH5调控过氧化物酶体前体囊泡在线粒体的形成和分离，从而调控过氧化物酶体的从头生成。具体而言，MARCH5的缺失特异性地阻碍线粒体中PEX3囊泡的出芽，从而阻断了过氧化物酶体前体的形成。线粒体定位的PEX3有效富集在线粒体来源囊泡（MDV）中，这一过程依赖PEX3的核心结构域，也依赖于MARCH5。该研究强调了MARCH5调控线粒体来源的过氧化物酶体前体囊泡生成的作用，揭示其是一种维持过氧化物酶体稳态的调节因子[12]。
首先，研究者在过氧化物酶体缺陷细胞中重建过氧化物酶体从头生物合成。通过敲除内源性PEX3基因（PEX3 KO）建立过氧化物酶体缺陷的HeLa细胞。PEX3是一种组装功能性过氧化物酶体所必需的过氧化物酶体膜蛋白（PMP），其缺失会导致PMP的错误定位，最终导致功能性过氧化物酶体的缺失。检测GFP-SKL（GFP与过氧化物酶体靶向序列丝氨酸-赖氨酸-亮氨酸融合）的细胞质分布证实，PEX3 KO细胞中缺乏功能性过氧化物酶体。研究者通过回补PEX3-YFP来观察过氧化物酶体从头生物生成的不同阶段。最初，在PEX3存在的情况下观察到管状结构（阶段0），并逐渐转化为囊泡形成（阶段I）。最后，观察到斑点状结构，表明成熟的功能过氧化物酶体形成（阶段II，图一A和B）。使用MitoTracker或抗TOMM20抗体对线粒体进行染色，研究在此过程中PEX3与线粒体的亚细胞定位。在阶段0，PEX3-YFP仅位于线粒体上，表现为与MitoTracker和TOMM20共定位（图一C和D）；在阶段II，PEX3-YFP位于成熟的过氧化物酶体上，与mCherry-SKL和ABCD3共定位（图一C和D）。而阶段I是一个中间过渡阶段，此时PEX3-YFP在线粒体（连续管状结构）和过氧化物酶体前体（点状结构）上双重定位。进一步验证阶段I细胞中含有PEX3-YFP的点状结构是否是过氧化物酶体前囊泡，对细胞进行另一种PMP PEX14的染色。在没有过氧化物酶体的情况下，PEX14定位在线粒体上；过表达PEX3-YFP后，PEX14与PEX3-YFP共定位在过氧化物酶体前体中（图一E）。结构光照明显微成像（SIM）发现PEX3-YFP为圆形结构，表明囊泡的形成（图一F）。以上数据表明，在PEX3敲除细胞中外源表达PEX3，可以从线粒体重建过氧化物酶体的从头生物合成。
图一 PEX3-YFP可在过氧化物酶体缺陷细胞中恢复过氧化物酶体的从头合成[12]
接着，研究者探究MARCH5在过氧化物酶体从头生物合成中的作用。构建MARCH5和PEX3双敲除细胞系（DKO），比较过氧化物酶体在PEX3 KO和DKO细胞中的生物合成。当重新引入PEX3-YFP可以恢复PEX3 KO细胞中的过氧化物酶体，表现为PEX3-YFP和ABCD3在线粒体外的共定位（图二A-C）。然而，在没有MARCH5的情况下，PEX3-YFP和ABCD3都仅在线粒体上共定位（图二A-C），表明没有形成新的过氧化物酶体，mCherry-SKL检测进一步证实了这一点。在DKO细胞中，PEX3-YFP保留在线粒体上，mCherry-SKL均匀分布在细胞质中（图二D）。统计分析证实，在没有功能性MARCH5的情况下，过氧化物酶体的从头生物合成被完全抑制（图二C）。出乎意料的是，还观察到ABCD3在DKO细胞线粒体上表达和定位，而在PEX3 KO细胞中没有（图二A和E）。ABCD3在PEX3 KO细胞中无法检测到，可能是由于缺乏过氧化物酶体。新形成的过氧化物酶体恢复了ABCD3和另一种PMP PEX11b的表达。在缺乏MARCH5的DKO细胞中，观察到ABCD3而非PEX11b表现出内源性表达，与外源性PEX3表达无关（图二E）。MARCH5作为一种泛素连接酶，在过氧化物酶体上靶向ABCD3进行泛素化[11]，提示很可能MARCH5介导了ABCD3在线粒体上的降解。MARCH5蛋白由三个不同的组成部分组成，研究者发现MARCH5蛋白的RING结构域和C端细胞质结构域（CTD）在MARCH5介导的过氧化物酶体从头生物生成中有着重要作用。以上数据表明，MARCH5是介导线粒体来源的过氧化物酶体从头生物合成所必需的。
图二 MARCH5的缺失阻断了线粒体来源的过氧化物酶体从头生物合成[12]
来源于线粒体的过氧化物酶前体可被视为一种形式的MDV，因此过氧化物酶体缺陷细胞是研究MDV的良好模型。在没有过氧化物酶体的情况下，多种过表达的过氧化物酶体蛋白质会定位到线粒体，可能影响线粒体质量控制[13]。为了测试含有PEX3的过氧化物酶前体是否在线粒体质量控制的监测范围内，研究者用自噬抑制剂氯喹（CQ）处理细胞。在CQ存在的情况下，除了成熟的功能性过氧化物酶体，还有一部分PEX3阳性囊泡缺乏基质蛋白mCherry-SKL（图三A）。计算所有含PEX3的囊泡（YFP阳性）中过氧化物酶体前体（YFP阳性，mCherry阴性）的百分比（图三B），发现过氧化物酶体前体的数量随着CQ处理而增加。表明在正常条件下，这些含PEX3的囊泡在成熟为功能性过氧化物酶体之前会持续降解（图三C）。PEX19是一种与PEX3共同参与过氧化物酶体膜蛋白易位的胞质蛋白伴侣蛋白。为了进一步细化过氧化物酶体的出芽步骤和成熟步骤，研究者建立了PEX19敲除细胞系（PEX19 KO），由于缺乏PEX19，过氧化物酶体成熟应该被阻断。PEX3-YFP主要定位在PEX19 KO细胞的线粒体上，但在CQ处理后出现大量线粒体外PEX3-YFP囊泡（图三D和E）。这一结果进一步证实了PEX3从线粒体出芽，形成过氧化物酶体前体样囊泡，如果不能成熟为功能性过氧化物酶体，这些囊泡则会迅速降解（图三F）。在PEX19 KO细胞中实时监测含有PEX3的囊泡的形成。在72分钟的观测时长中，PEX3-YFP最初位于线粒体上，与MitoTracker信号重叠；随后，在同一位置YFP信号逐渐增加，同时MitoTracker信号减少；最终，含有PEX3的囊泡与线粒体分离（图三G）。SIM成像显示PEX3-YFP斑点的囊泡结构（图三H）。以上数据表明，含有PEX3的囊泡由线粒体主动形成，随后降解或成熟为过氧化物酶体。
图三 PEX3从线粒体出芽形成囊泡[12]
在MARCH5和PEX3 DKO细胞中，没有形成过氧化物酶体。尚不清楚MARCH5的缺失是否会影响过氧化物酶体前体的产生或降解，从而导致过氧化物酶酶体前体的缺失。为了区分这两种可能性，研究者在MARCH5和PEX3 DKO细胞中引入了PEX3-YFP，并用CQ处理细胞，结果显示线粒体外未观察到PEX3-YFP斑点（图三I），表明MARCH5调节线粒体过氧化物酶体的生物合成。进一步探究MARCH5在线粒体介导过氧化物酶体生物合成中的具体作用，确定MARCH5是否参与了这一过程中的囊泡出芽或成熟。研究者构建了MARCH5和PEX19双敲除细胞系。在PEX19 KO细胞中，过表达的PEX3-YFP经CQ处理后能形成囊泡，但在MARCH5和PEX19 DKO细胞中仅定位于线粒体上（图三J），表明没有MARCH5就不能形成含PEX3的囊泡。以上数据表明，MARCH5调控线粒体的PEX3囊泡出芽。
最后，研究者探索其他过氧化物酶体膜蛋白能否诱导MDV的形成，表达荧光蛋白融合另外两种PMP，PEX12和PEX26。这两种蛋白质都靶向PEX3敲除细胞中的线粒体。然而 ，在CQ存在的情况下，观察到PEX26没有与线粒体共定位，形成了PEX26囊泡，但PEX12不能形成囊泡（图四A和B）。研究者构建了泛素化的Ub-GFP SKL，可防止内源性去泛素化酶的切割。在细胞质中，Ub-GFP SKL可被泛素-蛋白酶体系统快速降解，但一旦定位于过氧化物酶体/囊泡就受到保护。即只有形成成熟的过氧化物酶体，才会观察到GFP信号。尽管PEX26和PEX3都能形成线粒体外囊泡，但只有PEX3囊泡能成熟为过氧化物酶体（图四A）。MARCH5的缺失并不影响PEX26囊泡的形成（图四C和D）。SIM成像进一步验证含有PEX26的斑点是囊泡（图四E）。与PEX3囊泡相比，PEX26囊泡的形成独立于MARCH5（图四F）。以上数据表明，MARCH5特异性地控制线粒体来源PEX3阳性囊泡的形成，这是过氧化物酶体从头生物合成的主要步骤之一。
图四 MARCH5的缺失特异性抑制PEX3囊泡的出芽步骤[12]
综上所述，该研究发现了泛素连接酶MARCH5在过氧化物酶体从头生物合成中至关重要。MARCH5缺失通过阻断线粒体PEX3囊泡的出芽，进而阻断过氧化物酶体前体的形成。此外，MARCH5选择性调控线粒体中PEX3囊泡的出芽，而不影响其他的如线粒体来源PEX26囊泡。该研究揭示了MARCH5和PEX3在线粒体来源过氧化物酶体前体的形成中起着不可或缺的作用，丰富了过氧化物酶体从头生物合成的机制，为调控细胞内过氧化物酶体功能提供了潜在靶点。
GTP研发中心拥有自主知识产权的“人造精子细胞”介导的半克隆技术，可在体外实现“人造精子细胞”的多位点改造并进行功能元件测试，最后将“人造精子细胞”通过卵母细胞注射可以一步法获得基因改造小鼠。基于“人造精子细胞”单倍体打靶高效率的优势，可快速构建定制化小鼠，如基因组安全位点大片段敲入、条件性基因敲除/敲入和人源化基因改造等。多个复杂调控元件可以通过多次体外细胞打靶构建在同一株“人造精子细胞”中，经细胞水平质控后，一步法获得基因改造小鼠。
如有需要欢迎联系我们，GTP研发中心将竭诚为您设计最佳方案，制定专属于您的基因改造小鼠。
网址：http://www.sibcb.ac.cn/gtp/
地址：上海市岳阳路320号
责任编辑：甜点
新媒体运营：suway
参考文献
1. Hoepfner D, Schildknegt D, Braakman I, Philippsen P, Tabak HF: Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell 2005, 122(1):85-95.
2. Sugiura A, Mattie S, Prudent J, McBride HM: Newly born peroxisomes are a hybrid of mitochondrial and ER-derived pre-peroxisomes. Nature 2017, 542(7640):251-254.
3. Uoselis L, Nguyen TN, Lazarou M: Mitochondrial degradation: Mitophagy and beyond. Molecular cell 2023, 83(19):3404-3420.
4. Youle RJ, Narendra DP: Mechanisms of mitophagy. Nature reviews Molecular cell biology 2011, 12(1):9-14.
5. McLelland GL, Soubannier V, Chen CX, McBride HM, Fon EA: Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. Embo J 2014, 33(4):282-295.
6. Soubannier V, Rippstein P, Kaufman BA, Shoubridge EA, McBride HM: Reconstitution of mitochondria derived vesicle formation demonstrates selective enrichment of oxidized cargo. PloS one 2012, 7(12):e52830.
7. König T, Nolte H, Aaltonen MJ: MIROs and DRP1 drive mitochondrial-derived vesicle biogenesis and promote quality control. 2021, 23(12):1271-1286.
8. Neuspiel M, Schauss AC, Braschi E, Zunino R, Rippstein P, Rachubinski RA, Andrade-Navarro MA, McBride HM: Cargo-selected transport from the mitochondria to peroxisomes is mediated by vesicular carriers. Current biology : CB 2008, 18(2):102-108.
9. Kim HJ, Nagano Y, Choi SJ, Park SY, Kim H, Yao TP, Lee JY: HDAC6 maintains mitochondrial connectivity under hypoxic stress by suppressing MARCH5/MITOL dependent MFN2 degradation. Biochemical and biophysical research communications 2015, 464(4):1235-1240.
10. Fang L, Hemion C, Goldblum D, Meyer P, Orgül S, Frank S, Flammer J, Neutzner A: Inactivation of MARCH5 prevents mitochondrial fragmentation and interferes with cell death in a neuronal cell model. PloS one 2012, 7(12):e52637.
11. Zheng J, Chen X, Liu Q, Zhong G, Zhuang M: Ubiquitin ligase MARCH5 localizes to peroxisomes to regulate pexophagy. 2022, 221(1).
12. Zheng J, Chen J, Cao Z, Wu K, Wang J, Guo Y, Zhuang M: Ubiquitin ligase MARCH5 controls the formation of mitochondria-derived pre-peroxisomes. Developmental cell 2024.
13. Nuebel E, Morgan JT: The biochemical basis of mitochondrial dysfunction in Zellweger Spectrum Disorder. 2021, 22(10):e51991.
